BAB IV
ISOLASI
SENYAWA AKTIF
Bahan
kimia yang berasal dari tumbuhan atau hewan disebut bahan alam. Banyak bahan alam yang berguna seperti untuk
pewarna, pemanis, pengawet, bahan obat dan pewangi. Bahan alam yang beraneka
ragam itu, pada umumnya dikelompokkan berdasarkan kesamaan strukturnya atau
jalur biosintesisnya. Beberapa kelompok bahan alam ialah lipid, protein, karbohidrat, alkaloid, flavonoid,
terpenoid dan sebagainya.Isolasi bahan alam dilakukan berdasarkan sifat bahan
alam tersebut, dan dapat digolongkan menjadi isolasi cara fisis dan isolasi
cara kimia.
Hubungan diameter kolom, berat silika gel dan berat sampel untuk KVC
A.
Isolasi Cara Fisis
Isolasi cara
ini berdasarkan sifat
fisik bahan alam,
seperti kelarutan dan tekanan
uap. Isolasi berdasarkan
perbedaan kelarutan bahan
alam dalam pelarut tertentu
dapat dilakukan dengan pelarut dingin
atau pelarut panas. Isolasi dengan pelarut dingin digunakan untuk mengisolasi
bahan alam yang dapat larut dalam
keadaan dingin. Tekniknya
dapat dilakukan dengan merendam sumber bahan alamnya dalam
pelarut tertentu selama beberapa lama
(jam atau hari). Untuk bahan alam yang larut dalam keadaan panas digunakan teknik isolasi secara
kontinyu dengan alat Soxhlet.
Isolasi
berdasarkan penurunan tekanan uap dilakukan dengan cara destilasi uap. Cara
ini digunakan untuk senyawa yang tidak
larut dalarn air, bertitik didih tinggi, mudah terurai sebelum titik didihnya
dan mudah menguap.
B.
Isolasi Secara Kimia
Isolasi
cara ini berdasarkan sifat kimia atau kereaktifan bahan alam terhadap pereaksi
tertentu. Bahan alam diisolasi melalui reaksi kimia dan dipisahkan dari senyawa
lain yang tidak bereaksi.
3 (Tiga) tahapan isolasi : ekstraksi,
fraksinasi, dan pemurnian
Fraksinasi
— Dua cara yang lazim digunakan; untuk
fraksinasi, yaitu partisi dan kromatografi.
— Partisi dilakukan apabila jumlah komponen
di dalam ektrak terdapat puluhan senyawa. Dasar dari pemisahan dengan cara
partisi adalah perbedaan kelarutan, dan syarat yang harus dipenuhi untuk melakukan
hal ini adalah bahwa dua pelarut yang digunakan tidak saling bercampur. Dua
pelarut yang tidak saling bercampur adalah n-heksana-metanol, kloroform-air, dan etil asetat-air.
— Cara yang lebih eksak dalam melakukan
fraksinasi adalah dengan cara kromatografi, terutama jika komponen utama di
dalam suatu ekstrak atau fraksi hanya sekitar sepuluh atau belasan. Teknik
kromatografi yang sangat dianjurkan untuk melakukan hal ini adalah kromatografi
vakum cair (KVC) menggunakan kolom silika gel.
Analisis komponen dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
Ada 2 tujuan :
1. Untuk
analisis, mengetahui berapa jumlah komponen (noda) yang ada dalam ekstrak atau
fraksi. Eluen campuran n-heksana-etil asetat, umumnya cocok untuk golongan terpenoid, sementara campuran kloroform-metanol cocok
untuk golongan fenolik.
a. Untuk
mencari fase gerak/eluen yang sesuai untuk proses fraksinasi.
Eluen
yang murah untuk tujuan ini adalah campuran n-heksana-etil asetat atau n-heksana-aseton.
Pemurnian
Beberapa teknik kromatografi
yang dapat digunakan untuk pemurnian adalah:
-Kromatografi Vakum Cair (KVC) -Kolom gravitasi
-Kromatografi Kolom Tekan (KKT) -KLT preparatif
-Kromatografi Radial (KR) -Kolom
Sephadex LH-20
Kromatografi Cair Vakum (KCV)(Vacuum Liquid Chromatography)
Kromatografi Kolom Tekan (KKT) (Flash Chromatography)
Kromatografi Kolom Tekan (KKT) (Flash Chromatography)
Pemurnian dengan cara KKT
a.
Analisis KLT untuk pencarian eluen/fase gerak.
Prinsipnya :
— dicari
eluen yang memisahkan noda kromatogram yang terbaik, dengan Rf = 0,2 – 0,3
(untuk noda yang ingin dimurnikan).
— untuk
senyawa flavonoid & turunannya, lazimnya dipakai campuran
(kloroform:n-heksana), (kloroform:etilasetat) atau (kloroform:metanol)
tergantung sifat polaritas dari chemical
marker yang akan dimurnikan.
— Untuk
senyawa terpenoid, lazimnya dipakai campuran n-heksana:etilasetat atau n-heksana:kloroform.
Prosedur KKT
2. Penyiapan kolom KKT
Prinsipnya :
— Berat
sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter kolom KKT yang
akan digunakan, dengan arahan ketentuan :
Ø
Tinggi silica dalam kolom 15 – 17 cm (Silica G
60 mesh 60 – 200, Katalog Merck : 7734)
Ø
Silica dalam kolom KKT dihomogenkan dengan eluen
(fase gerak) yang telah terpilih untuk pemurnian, hingga tidak nampak adanya
gelembung-gelembung udara (eluen boleh diulang-ulang untuk dimasukkan dalam
kolom KKT).
Ø
Catatan : selama mengelusi tidak boleh kering,
eluen tidak boleh melewati batas atas silica dalam kolom.
3.
Penyiapan sampel dengan silica impreg (mesh 30 –
70, Katalog : 7733)
Prinsipnya : sama dengan
impregnasi pada KVC
4.
Fraksinasi/pemurnian dengan KKT
Eluen
yang digunakan lazimnya hanya satu system campuran pelarut (polaritasnya
tetap), lazimnya dibutuhkan 250 – 500 mL.
— Masing-masing
fraksi ditampung dengan volume = 5 – 20 mL. Dan sebelum dihentikan atau
dibongkar, fraksi yang terakhir dianalisis KLT dengan dibandingkan dengan
sampelnya. Jika semua senyawa atau chemical
marker target sudah keluar semua, proses fraksinasi dapat dihentikan.
5.
Analisis KLT hasil fraksinasi/pemurnian =>
mirip pada KVC
6.
Analisis kemurnian hasil isolasi
Fraksi-fraksi
yang memberikan noda kromatogram tunggal dengan nilai Rf sama dengan standarnya, digabung dicek
kemurniannya, dielusi dengan 3 (tiga) system eluen yang berbeda-beda (sifat
polaritasnya).
Misal;
system I campuran heksana:etilasetat; system II campuran kloroform:metanol;
system III campuran
heksana:kloroform:etilasetat.
Kromatografi Radial (KR) (Radial/Centrifugal
Chromatography)
ISOLASI BERDASARKAN JENIS KANDUNGAN SENYAWA AKTIF
Kandungan kimia
simplisia nabati pada umumnya dapat dikelompokkan sebagai berikut: minyak
atsiri, karotenoid, steroid, triterpenoid, alkaloid, asam lemak, senyawa
senyawa fenolik yang meliputi fenol-fenol, asam fenolat, fenilpropanoid,
antarkuinon, antosian serta xanton, asam organik, glikosida, saponin, tanin,
karbohidrat dan lain-lain. Dan untuk mencari/skrining kandungan kimia tumbuhan
tersebut dapat dilakukan penyarian bertingkat berdasarkan tingkat polaritasnya
dimulai dari pelarut non polar, semi polar dan terakhir pelarut polar.
1. SARI NONPOLAR
Senyawa
aktif yang terlarut antara lain: minyak atsiri, lemak dan asam lemak tinggi,
steroid dan karotenoid. Di samping golongan kandungan kimia tersebut dalam sari
ini kemungkinan terkandung pula klorofil dan resin yang bersama dengan lemak
lebih sering disebut sebagai pengotor.
2.
SARI SEMIPOLAR
Serbuk
sisa penyarian dengan pelarut non polar kemudian diekstraksi dengan pelarut
semi polar, dalam ekstrak semipolar akan mengandung senyawa-senyawa kimia
sebagai berikut: alkaloid; senyawa fenolik (fenol-fenol, asam fenolat,
fenilpropanoid, flavonoid, antrakinon, xanton, stilben); komponen minyak atsiri
tertentu dan asam lemak
3. SARI POLAR
Sari
polar mengandung zat-zat kimia sebagai berikut: garam alkaloid, alkaloid basa
kuarterner dan amina teroksidasi, antosian, glikosida, saponin, tanin dan
karbohidrat.
a.
EKSTRAK
KASAR TUMBUHAN
Prosedur
untuk mengisolasi senyawa dari tumbuhan hampir beragam seperti senyawa itu
sendiri, tetapi terdapat metode yang pada umumnya berguna untuk segolongan
senyawa, buka metode yang pernah digunakan untuk mengisolasi senyawa tertentu
dalam suatu golongan. Sering kali senyawa tertentu masih tetap diisolasi dengan
cara coba-coba, bukan dengan metode mutakhir yang mempunyai kegunaan umum.
Jadi, sementara cara yang dianjurkan untuk memurnikan alkaloid yang tak dikenal
ialah dengan cara kromatografi memakai damar penukar kation. Pada penyiapan
bahan tumbuan dihindari terbentuknya senyawa jadian. Jika jaringan hidup
diproses terlalu lambat, kerja enzim dapat menimbulkan perubahan yang besar pada
kandungan kimia tertentu. Proses penguraian yang paling umum ialah oksidasi dan
hidrolis, dan jika kita mencari kandungan kimia yang mungkin mengalami hal itu
kita harus berusaha untuk mencegahnya. Sebaliknya, jika jaringan dipanaskan untuk mencegah kerja enzim,
pengeringan memakai penguap putar pada suhu yang nisbi rendah pun dapat
menimbulkan reaksi kondensasi antara gula dan senyawa amino. Barangkali metode
umum yang paling aman untuk segala kemungkinan ialah mencelupkan bahan ke dalam
nitrogen cair diikuti dengan pengeringbekuan.
Ekstraksi
lipid dengan pelarut organik sering kali merupakan langkah awal dalam
fraksinasi dengan maksud memperoleh lipid atau menghilangkannya. Walaupun kloroform/metanol
merupakan pelarut tradisional untuk ekstraksi ini, campuran pelarut lain sama
efektifnya dan lebih aman. Karbon dioksida superkritik lebih banyak digunakan
sebagai pengekstraksi senyawa yang peka. Ekstraksi awal memakai pelarut
nonpolar dapat kita ganti dengan cara menjerap lipid memakai damar sintetik dan
kemudian mengelusinya dengan etanol absolut atau pelarut lain.
Beberapa
metode fraksinasi umum yang dapat digunakan untuk mengekstraksi jaringan
tumbuhan adalah berikut ini :
Ekstrak tumbuhan
(distilasi uap)
|
Tak menguap
(penukar kation)
|
Menguap
Asal
Alkohol
Karbonil
(penukar anion –HCO-3)
|
Efluen
(penukar anion –HCO-3)
|
Terserap
Senyawa amino alkaloid
|
Efluen
Penukar anion (HCO-3)
|
Terserap
senyawa karbonil
|
Kemudian pemisahan lebih lanjut berbagai
fraksi itu dapat dilakukan dengan memperhatikan sifat-sifat senyawa yang
dikehendaki. Disamping menggunakan kromatografi cair, kromatografi lawan arus
tetes terbukti berguna terutama untuk senyawa polar. Pada pemakaian damar
penukar ion kita harus berhati-hati karena adanya kemungkinan penjerapan yang
kuat senyawa aromatik yang tidak ada kaitannya dengan tahanan ionisasinya.
Senyawa yang terjerap seperti itu dapat dielusi dengan campuran alkohol air.
Beberapa strategi untuk membuat produk dari tumbuhan diuraikan dalam.
b. SENYAWA AKTIF GOLONGAN KARBOHIDRAT
Banyak karbonhidrat yang larut dalam
air. Ekstraksi bahan yang telah dihilangkan lemaknya dengan air didih netral akan
menyisakan polisakarida dinding sel dan bahan nonpolisakarida yang tidak larut. Ester oligasakarida hidrofob
dijumpai pada permukaan daun, dapat diperoleh dengan mencucinya ke dalam
diklorometana. Bebrapa pektin dapat diekstraksi dengan sikloheksana-asam
diamino tetra asetat tetapi beberapa lainnya memerlukan pereaksi yang lebih
kuat. Ekstraksi dengan larutan basa dingin menghilangkan hemiselulosa dan yang
tersisa selulosa. Kekuatan larutan basa dapat diubah-ubah jika menghendaki
ekstraksi hemiselulosa secara selektif. Biasanya yang dipakai ialah larutan KOH
24% (atau NaOH 17,5%) untuk mengekstraksi seluruh hemiselulosa dan akan
meninggalkan sisa yang dikenal sebagai’a-selulosa’ yang dapat mengandung 40%
polisakarida lain seperti xilan, manan, dan sebagainya bergantung pada
sumbernya. Oleh karena itu jelas bahwa ekstraksi basa tidak menghilangkan semua
hemiselulosa secara kuantitatif. Pemurnian selulosa basa lanjut dilakukan
dengan melarutkannya dalam asam fosfat 85% dan mengendapkannya dengan penambahan
tiga volume air suling. Selulosa yang diperoleh dengan cara ini telah mengalami
penguraian yang hebat (misalnya terbentuk rantai yang panjangnya sekitar 160
satuan glukosa dibandingkan dengan rantai asalnya yang terdiri atas beberapa
ribu satuan). Pemurnian sudah pasti disertai penguraian, dan selulosa asli yang
murni hanya dapat diperoleh dari sumber tumbuhan seperti kapas yang memang
sudah merupakan selulosa hampir murni.
Kembali
ke larutan hemisellosa dalam larutan basa, kita dapat memfraksinasi dengan cara
penambahan asam (pH sekitar 4,5) sehingga selulosa berbobot molekul tinggi
mengendap. Xilan rantai lurus dapat diendapkan dengan penambahan iod ke dalam
larutan hemiselulosa. Hemiselulosa yang masih tinggal dalam larutan dapat
diendapkan dengan penambahan aseton, alkohol atau sederet pelarut khas digunakan untuk
memfraksinasinya. Cara lain untuk memfraksinasi campuran hemiselulosa adalah
memakai selulosa penukar ion atau Sephadex dan pengendapan dengan ion logam
khas. Pemisahan memakai kromatrografi afinitas ternyata bermanfaat untuk
senyawa dengan rantai bercabang.
Ekstrak
air panas mengandung senyawa berbobot molekul rendah sebagai larutan dan
sebagai suspensi koloid polisakarida hidrofil (dan bahan nonkarbonhidrat
seperti asam organik dan asam amino). Jika kita mengetahui ada fruktan, lebih
baik kita menggunakan cara ekstraksi dingin karena beberapa fruktan mudah
terhidolisis. Polisakarida yang terdapat dalam ekstrak air mungkin gom,
musilago, pati, fruktan, senyawa pektin, galaktomanan, dan sebagainya, bergantung
pada sumbernya. Untuk memisahkan salah satu jenis karbonhidrat dari jenis yang
lainnya tidak diperlukan metode umum karena dalam tumbuhan tertentu paling
banyak hanya terdapat dua atau tiga jenis karbonhidrat. Umumnya, semua jenis
karbonhidrat dapat diendapkan dengan menambahkan etanol sampai konsentrasi 80%.
Amonim sulfat 0,5% dapat membantu pengendapan dengan etanol. Akan tetapi,
beberapa fruktan rantai pendek terlarut dalam etanol 80%. Amilosa dan
amilopektin dapat pua dipisahkan dengan memakai kromatografi filtrasi gel.
Karbonhidrat
berbobot molekul rendah dapat diperoleh dari beningan etanol 80% atau dapat
diekstraksi langsung dari bahan tumbuhan dengan memakai etanol atau 2-propanol
sehingga konsentrasi akhir 80% jika terncerkan dengan air yang terdapat dalam
bahan. Beberapa komponen (misalnya difosfat) terikat sangat kuat pada jaringan
dan harus diekstraksi dengan etanol 20% atau pelarut lain. Senyawa ion (garam,
asam amino, asam organik) dihilangkan paling baik dengan damar penukar ion
walaupun damar basa kuat atau damar asam kuat dapat mempengaruhi gula. Asam
gula dan fosfat gula dapat dihilangkan dengan damar penukar anion, pemisahannya
dari komponen nonkarbonhidrat dapat dilakukan dengan cara pengirisan fraksi
yang cocok, atau dengan fosfat, dengan pengendapan memakai barium hidroksida
dan pengubahan menjadi garam natrium.
Metode
khusus untuk memurnikan gula netral yang tersisa dapat dilakukan jika salah
satu komponen konsentrasinya nisbi besar, pemekatan larutan secara sederhana
mungkin dapat mengkristalkannya. Metode yang paling umum untuk memurnikan gula
netral dan keturunannya ialah kromatografi kolom pemakai penjerap arang, serbuk
selulosa, pati, dan florex, dengan pelarut pengembang yang agak polar seperti
alkohol rendah dan campuran alkohol rendah dengan air. Dengan penambahan borat,
senyawa polihidroksi membentuk senyawa komples borat anion yang dapat
dipisahkan pada kolom damar penukar anion memakai dapat borat sebagai pengelusi.
Setelah dielusi kation dihilangkan dari fraksi dengan damar penukar kation dan
borat dihilangkan sebagai metil borat yang atsiri dengan cara distilasi dengan
metanol secara berulang-ulang. Metode penukar ion tanpa borat dapat digunakan
untuk senyawa karbohidrat yang memang sudah mempunyai gugus ion. Pada pH tinggi
banyak karbonhidrat yang bersifat anion dan dapat dipisahkan dengan damar
penukar ion. Damar penukar kation juga telah digunakan dalam berbagai situasi
tertentu. Campuran gula dapat pula dipisahkan berdasarkan ukuran molekul pada
medium filtrasi gel. Kromatografi cair kinerja tinggi telah pula digunakan
secara preparatif untuk berbagai karbonhidrat.
Garis besar umum tata kerja
yang dipaparkan tadi diberikan dalam bagan berikut :
BAHAN KASAR
(ekstraksi dengan air mendidih)
Tak larut
Ekstraksi
dengan NaOH 17,5%
|
Endapan hemiselulosa bobot molekul tinggi
|
Larut hemilulosa bobot molekul rendah
|
Larut
Tambah
etanol sampai 80%
|
Larut
Damar
penukar anion
|
Tak larut
Endapan
pektin pati gom misulago fruktan
|
Efluen
Monosakarida
oligosakarida
|
c.
SENYAWA AKTIF ASAM ORGANIK
Pada
prosedur baku untuk mengisolasi asam yang berbobot molekul rendah, bahan
tumbuhan diasamkan (pH 1,0) dengan asam sulfat dan kemudian diekstraksi secara
sempurna (kadang-kadang selama beberapa hari) dengan eter bebas peroksida.
Ekstrak eter mengandung asam bebas, yang dapat dimurnikan lebih lanjut.
Prosedur ini paling cocok dipakai untuk bahan kering, tetapi kesukaran dalam
pengeringan bahan tumbuhan secara aman dapat meniadakan kesederhanaan prosedur
ekstraksi. Pengeringan dengan menggunakan bahan dapat menghilangkan asam
atsiri, merusak asam keto, menyebabkan pengesteran, dan sebagainya.
Pengeringbekuan tidak diragukan lagi merupakan metode terbaik karena cara ini
tidak memungkinkan terjadinya perubahan kimia, tetapi asam yang atsiri atau
ester dapat hilang. Jika bahan tumbuhan dinetralkan sebelum pengeringan, semua
asam akan menjadi garam yang takatsiri. Lipid dan ester yang mengganggu dapat
pula dihilangkan dengan cara ekstraksi pendahuluan memakai eter terhadap bahan
yang dinetralkan.
Sebagai
pengganti ekstraksi memakai eter, asam tumbuhan dapat dipekatkan dengan memakai
damar penukar anion. Jika ekstraksi tumbuhan dilewatkan melalui kolom yang
berisi damar penukar anion bersifat basa lemah dalam bentuk hidroksida, anion
akan di tambat. Setelah kolom dicuci, asam bebas dapat dielusi dengan HC1 0,1M.
Jika beberapa fraksi eluat diambil, sampai batas tertentu, pemisahan asam dapat
dicapai. Berbahaya jika kita memakai damar penukar anion yang bersifat basa
kuat dalam bentuk hidroksidanya, karena gula di dalam ekstrak tumbuhan akan
terurai menjadi asam seperti asam laktat dan glikolat.
Setelah
menyiapkan ekstrak pekat yang mengandung seluruh asam organik dapat dipisahkan
masing-masing komponen. Jika campuran asam diperoleh dengan cara ekstraksi
memakai eter, campuran itu harus dialihkan dari eter ke air dengan cara
mengocoknya memakai larutan natrium hidroksida. Natrium sulfat dapat dihilangkan
dengan mengatur pH larutan dalam air menjadi satu memakai asam sulfat, lalu ditambahkan
dua volum etanol, dan larutan dibiarkan semalam dalam lemari es. Kemudian
larutan asam organik dipisahkan dari endapan antrium sulfat dengan penyaringan.
Asam lemak rendah sampai asam kaproat (C6) dapat menguap bersama-sama dengan
uap air dan dapat diisolasi dengan cara distilasi uap. Asam kaprilat (C8) dan
asam kaprat (C10) hanya menguap sedikit dengan uap air, oleh karena itu untuk
mengisolasinya secara sempurna memerlukan waktu lama. Pemisahan berbagai asam
lemak yang atsiri ini dapat dilakukan dengan mengkromatografi gas campuran atau
mengkromatografi partisi pada silika gel memakai pelarut butanol dalam
kloroform untuk asam C1 – C4 dan metanol dalam isooktana untuk asam C5-C10.
Distilasi bertingkat tidak efesien untuk memisahkan asam yang perbedaannya
hanya dua atom karbon dan hanya berguna jika kita mempunyai bahan yang agak
banyak.
Pemisahan
asam yang tak atsiri lainnya seringkali dilakukan dengan mengubah asam bebas
menjadi ester metil lalu didistilasi bertingkat. Akan tetapi, dengan cara ini sulit
untuk memisahkan secara sempurna kecuali jika campuran yang dipisah jumlahnya
besar. Metode pemisahan lain didasarkan pada perbedaan kelarutan garam timbal,
barium, dan kalsium di dalam air dan dalam alkohol, tetapi, sekali lagi, metode
ini pun hanya cocok jika kita mengetahui bahwa julah asam terbatas sehingga
strategi dapat didasarkan pada kelarutan asam tersebut. Khususnya, asam oksalat
dapat dipisahkan dari semua asam yang lainnya berdasarkan kelarutan garam
kalsiumnya yang sangat kecil dalam air. Asam keto dapat dihilangkan dari
larutan dalam air dengan cara menambahkan 2,4-dinitrofenildrazina untuk
mengendapkannya sebagai hidrazon, senyawa 2,4-dinitrofenilhidrazon yang
terbentuk dapat diekstraksi dengan eter dan dimurnikan lebih lanjut dengan cara
kristalisasi atau krimatografi. Kromatografi kolom 2,4-dinitrofenilhidrazon
dapat dilakukan memakai tanah diatome (‘celite’) dengan pelarut etanol dalam
eter atau memakai serbuk selulosa dengan pelarut n-amilalkohol yang dijenuhkan
dengan amonia. Ketidakstabilan sebagian besar asam keto menyebabkan kita harus
memisahkannya sebagai senyawa turunan bukan sebagai asam bebas.
Prosedur
paling baik yang dapat dipakai secara umum untuk memisahkan dan mengisolasi
asam tumbuhan dari suatu campuran ialah kromatografi kolom memakai metode
pertukaran ion atau partisi. Daya pisah per gram damar lebih besar daripada
penyerap partisi, tetapi penyerap partisi mempunyai keuntungan karena dapat
ditambahi indikator untuk memantau gerak pita asam melalui kolom, dan tampaknya
penyerap ini memungknkan pemisahan agak lebih bersih. Pemisahan secara
pertukaran ion dapat dilakukan memakai damar bersifat basa kuat dalam bentuk
hidroksida jika gula telah dihilangkan pada tahap pemurnian pendahuluan. Tidak
ada prosedur umum yang dapat disarankan karena penyiapan kolom dan metode elusi
beragam bergantung pada asam yang akan dipisahkan. Asam klorida 0,1M sering
dipakai sebagai pengelusi, fraksi-fraksi dikumpulkan, dan asam dianalisis
dengan cara kromatografi kertas atau reaksi warna yang khas. Kemudian
fraksi-fraksi yang sesuai digabung dan dipekatkan untuk memeroleh asam yang
murni. Beberapa ratus mg campuran asam dapat dipisahkan dengan hanya memakai 10
g damar. Asam monokarboksilat keluar terlebih dahulu, diikuti oleh asam di- dan
trikarboksilat.
Pemisahan
secara kromatografi partisi menggunakan pendukung untuk fase diam yang
mengandung air bahan-bahan seperti silika gel, celite, atau serbuk selulosa.
Untuk menekan pengionan asam kita harus mencampur penjerap dengan sedikit asam
mineral encer dan untuk memastikan pengionan asam secara sempurna kita harus
mencampur penjerap dengan amonium hidroksida. Dalam hal yang terakhir,
indikator seperti bromkresol hijau dapat ditambahkan dan akan berubah warnanya
jika ada pita asam. Fase gerak yang paling umum dipakai ialah campuran
1-butanol dan kloroform (dijenuhkan dengan fase diam). Perbandingan kedua
pelarut tersebut di ubah-ubah sesuai dengan kepolaran asam yang dipisah, sering
disarankan untuk meningkatkan perlahan-lahan nisbah butanol/kloroform selama
pengelusian. Dalam beberapa kasus pemakaian etil eter sebagai fase gerak dapat
memisahkan pasangan-pasangan yang tidak dapat dipisahkan dengan butanol/kloroform.
d. SENYAWA AROMATIK
Banyak senyawa aromatik sederhana yang terdapat dalam
tumbuhan mempunyai gugus hidroksil fenol bebas, gugus karboksil, atau keduanya.
Asam karboksilat dapat diekstraksi dari bahan tumbuhan atau ekstrak eter bahan
tumbuhan dengan larutan natrium bikarbonat 2%. Jika larutan ini diasamkan,
sering kali asam mengendap atau dapat diekstraksi dengan eter. Setelah asam
karboksilat diekstraksi, fenol dapat diekstraksi dengan larutan natrium
hidroksida 5%. Seperti pada asam, fenol dapat diendapkan atau diekstraksi
dengan eter setelah diasamkan. Oleh karena banyak fenol sangat peka terhadap
oksidasi dalam lingkungan bersifat basa, maka dianjurkan untuk mengganti
lingkungan udara dengan nitrogen atau menambahkan pereduksi seperti natrium
ditionit pada saat perlakuan dengan basa.
Beberapa senyawa aromatik yang berbobot molekul
rendah dapat dimurnikan dengan cara distilasi atau sublimasi pada tekanan atmosfir atau tekanan rendah. Fenol
biasanya tidak dapat didistilasi uap, tetapi eter atau esternya, oleh karena
kepolarannya lebih rendah daripada senyawa hidroksil induknya, sering kali dapat
didistilasi uap.
Cara ekstraksi memakai pelarut dipakai secara luas pada
pemurnian senyawa aromatik alam. Pelarut organik umum seperti aseton, eter, dan
benzena sering dipakai. Partisi berulang memakai air atau larutan dapar dengan
pelarut organik yang tidak bercampur dengan air telah dipakai untuk memurnikan
senyawa yang mempunyai sifat kelarutan yang sesuai. Tanin terhidrolisiskan dan
glikosida dapat diekstraksi dengan air panas atau campuran etanol-air. Damar
sintetik, baik yang
berbentuk ion maupun yang tidak bermuatan, ternyata berguna untuk menghilangkan
senyawa fenol dari ekstrak tumbuhan . Gel dekstran menjerap juga berbagai
senyawa aromatik.
Naftokuinon dapat diekstraksi dari jaringan
tumbuhan dengan benzena atau pelarut nonpolar lainnya. Sering kali 1,4-kuinon
dapat didistilasi uap dan dapat dipisahkan dari berbagai lipid lain dengan cara
ini. Sifat lain yang dapat digunakan pada pemisahannya dari lipid lain ialah kelarutannya
dalam air pada
lingkungan basa lemah seperti natrium karbonat atau bikarbonat. Perlakuan
dengan basa kuat disertai adanya udara sering kali menimbulkan penguraian
secara oksidasi. Senyawa 1,4-kuinon
tidak dapat didistilasi uap, tetapi larut dalam larutan natrium bisulfit.
Pemurnian akhir dapat dilakukan dengan cara kromatografi pada alumina yang diawaaktifkan atau penjerap yang
lebih lemah.
Pada pemurnian kumarin, bahan atau ekstrak kasar
dapat diperlakukan dengan larutan basa encer hangat untuk membuka cincin lakton dan membentuk
natrium kumarinat yang larut dalam air. Pencemar organik netral kemudian dapat
diekstraksi dengan eter. Jika larutan dalam air diasamkan kumarin terbentuk
lagi sehingga kumarin dan senyawa asam yang ada dapat diekstraksi dengan eter.
Pencemar yang bersifat asam kemudian dapat dihilangkan dari eter dengan cara
mengocok memakai larutan natrium bikarbonat.
Lignan dapat diekstraksi dengan aseton atau
etanol dan sering kali diendapkan sebagai garam kalium yang sukar larut dengan
cara menambahkan larutan kalium hidroksida pekat dalam air ke dalam larutan lignan
dalam alkohol. Akan tetapi, asam atau basa sering menimbulkan pengisomeran. Apa
yang disebut 'lignin asli' dapat diekstraksi dari serbuk gergaji memakai aseton
atau alkohol pada suhu kamar. Akan tetapi, cara ekstraksi ini hanya dapat
mengambil 0,5 sampai 3% dari lignin keseluruhan. Kelarutan lignin dapat
ditingkatkan sedikit dengan menggiling tepung kayu memakai penggiling bola (ball
mill) sampai diperoleh serbuk sangat halus. Cara lain ialah
menghilangkan selulose dari kayu dengan membiarkan fungus atau selulose yang
telah dimurnikan bekerja pada serbuk gergaji. Dengan cara ini 25-30% dari
lignin keseluruhan dapat diperoleh dalam bentuk yang dapat larut.
Cara
tradisional penyiapan tanin tumbuhan menggunakan cara ekstraksi dengan air
panas, penggaraman dengan natrium klorida, pengekstraksian kembali endapan
dengan aseton, dan penghilangan lipid dari bahan yang larut dalam aseton dengan
eter. Dengan penambahan natrium klorida sedikit demi sedikit dapat terjadi
pengendapan bertingkat campuran tanin. Timbal atau seng asetat (10%) sering
dipakai untuk mengendapkan tanin yang dapat dihilangkan dari endapan dengan
cara penguraian memakai pereaksi hidrogen sufida. Gelatin membentuk endapan
juga dengan larutan tanin dalam air.
Kemudian etanol dapat digunakan untuk melarutkan kembali tanin dari endapan
tersebut. Pengendapan dengan cara menambahkan larutan kalium asetat dalam
alkohol ke dalam larutan tanin dalam alkohol sering mempunyai nilai preparatif
pada isolasi tanin. Tanin dapat diendapkan dengan kafeina dan kemudian dapat
diperoleh kembali dengan cara mengekstraksi sinambung kafeina memakai kloroform.
Cara
kromatografi telah digunakan pada pemurnian hampir semua jenis senyawa, kromatografi
gel bersifat lipofil telah dipakai untuk berbagai macam senyawa aromatik.
Kromatografi pada alumina dengan memakai pelarut seperti etil asetat atau
campuran etil asetat-metanol dapat memisahkan lignan atau kumarin. Tanin dari
kayu telah dimurnikan dengan kromatografi fase-balik. Senyawa fenol yang mempunyai gugus
karboksil bebas dapat dipisahkan dari fenol yang kurang asam dengan cara
kromatografi pertukaran anion, tetapi semua senyawa aromatik, sampai batas
tertentu, terikat ke polimer dasar-polistirena karena gaya nonionik. Glikosida senyawa aromatik dapat
dipisahkan dari aglikonnya memakai kolom polistirena. Cara baru, kromatografi lawan arus dan kromatografi
sentrifugal telah dimanfaatkan dengan baik untuk banyak jenis senyawa fenol.
e. SENYAWA GOLONGAN LIPID
Isolasi
berbagai golongan lipid sangat mengandalkan perbedaan kelarutannya. Sama
seperti pada penanganan sebagian besar hasil tumbuhan lain, tindakan pencegahan
pertama yang harus diperhatikan ialah menindakaktifkan enzim pengurai dan enzim
pengalih dengan pemanasan sebelum penghancuran jaringan tumbuhan. Tindakan pencegahan
ini terutama diperlukan untuk fosfolipid; dan pembekuan tidak mencegah
penguraian. Tindakan pencegahan kedua yang harus dilakukan jika mengisolasi
lipid yang mempunyai banyak ikatan rangkap ialah menghindari oksigen dan cahaya
kuat.
Lipid keseluruhan dapat diekstraksi dari jaringan dengan campuran
metanol/kloroform atau etanol/kloroform; tetapi karena daya racun
kloroform campuran pelarut lain menjadi lebih disukai misalnya metanol/eter
minyak bumi atau 2-propanol/heksana. Sering digunakan pelarut yang mendidih,
tetapi penghomogenan pada suhu kamar memperkecil kemungkinan penguraian. Jika
kita hanya menghendaki lipid nonpolar dan tak terikat, kita dapat menghilangkan alkohol sebagai pelarut
pengekstraksi atau dipakai pelarut seperti benzena, eter minyak bumi, dan
sebagainya. Untuk mengekstraksi lipid biji pelarut yang dianjurkan ialah
butanol yang jenuh dengan air. Kompleks lipid-protein atau lipid-karbohidrat
mungkin tidak larut dalam pelarut nonpolar. Dengan adanya alkohol senyawa
kompleks ini terurai, sehingga lipid yang terekstraksi tidak memberi petunjuk
bagaimana mereka terkompleks in situ. Sebaliknya, proteo-atau peptidolipid diketahui
larut dalam pelarut lipid tetapi pada hidrolisis melepaskan asam amino. Dengan
adanya fosfolipid banyak senyawa nonlipid yang terekstraksi dengan pelarut
lipid. Senyawa nonlipid ini dapat dihilangkan dengan baik dengan cara mencampur
ekstrak kloroform-metanol 2:1 dengan air sebanyak 0,2 volum ekstrak. Setelah
pemusingan atau dibiarkan lama untuk memisahkan lapisan, bahan nonlipid terdapat
pada lapisan air atas. Proteolipid membentuk lapisan halus-lunak pada antarmuka dan dapat dipisahkan dari komponen lain.
Pigmen klorofil yang akan terdapat dalam ekstrak lipid dari daun hijau dapat
dihilangkan dengan penjerapan memakai arang aktif .
Dengan menambahkan aseton pada ekstrak lipid
yang diperoleh dengan cara yang diuraikan di atas, fosfolipid (dengan sedikit
sterolin dan beberapa malam) sebagian besar diendapkan. Trigliserida, ester
lain, sterol, terpena, dan sebagainya
tetap dalam larutan. Akan tetapi, jika trigliserida banyak, senyawa ini akan
membawa fosfolipid sedikit ke fraksi yang larut dalam aseton. Fraksinasi
endapan fosfolipid, sampai batas tertentu, akan bergantung pada komponen jenis
apa yang ada. Metode ekstraksi bertingkat memakai aseton yang mengandung
etanolamina telah dirancang untuk memisahkan ketiga golongan lipid utama. Jika
kita menghendaki lipid inositol, fosfolipid lain dapat dipisahkan dengan
ekstraksi berlama-lama dengan asam asetat glasial
dingin dan partisi antara asam asetat glasial dan benzena. Lipid inositol
terlarut dalam fase benzena. Setelah penguapan benzena, sterolin (jika ada)
dapat dipisahkan dengan ekstraksi memakai campuran etanol-kloroform 2:1, yang
tinggal lipid inositol yang nisbi murni. Cara lain untuk fraksinasi fosfolipid
didasarkan pada pengendapan lesitin sebagai garam kadmium dari larutan dalam
alkohol. Setelah lesitin dipisahkan fosfolipid yang tertinggal dapat
difraksinasi dengan melarutkannya dalam kloroform dan kemudian ditambahkan
etanol secara bertahap. Lipid inositol mengendap lebih dahulu, diikuti oleh
fosfatidilserina, dan akhirnya fosfatidiletanolamina.
Tata kerja menggunakan distribusi lawan arus dan kromatografi memakai
DEAE-selulosa dan asam silikat telah dirancang untuk memisahkan berbagai
golongan lipid kompleks secara efisien dari daun.
Kita
kembali ke larutan lipid yang tertinggal setelah fosfolipid dipisahkan,
pemisahan komponen ini dalam bentuk aslinya sangat sukar. Asam lemak bebas
dapat dipisahkan dengan ekstraksi memakai larutan natrium karbonat, hidrokarbon
rantai panjang dan alkohol sebagai kompleks urea, dan sterol sebagai digitonida
atau tomatinida. Terpena rendah dan senyawa atsiri lain dapat dipisahkan dengan
cara distilasi (atau distilasi uap); asam terpenoid tinggi akan terekstraksi,
bersama-sama dengan asam lemak bebas, dengan larutan natrium
karbonat. Asam lemak rantai panjang kemudian dapat dipisahkan sebagai kompleks urea dari asam terpenoid tinggi. Glikolipid tidak diendapkan oleh aseton tetapi
dapat dipisahkan dari yang lain-lain, kecuali
trigliserida, dengan mempartisi campuran komponen yang larut dalam aseton memakai metanol-heptana.
Glikolipid (termasuk sterolin) dan trigliserida
masuk ke lapisan metanol. Pemisahan selanjutnya menggunakan kromatografi.
Campuran yang mengandung komponen utama
trigliserida dan/atau malam ester dapat
dipisahkan menjadi komponen esternya hanya dengan tata kerja yang memakan waktu lama dan tidak memuaskan
jika menghendaki lebih dari 1 mg. Cara yang paling umum digunakan ialah
distilasi bertingkat pada tekanan sangat rendah atau penghabluran bertingkat
dari aseton pada suhu sangat rendah. Tata kerja yang lebih lazim ialah
penghabluran ester dan kemudian mengidentifikasi komponen asam dan alkoholnya.
Trigliserida dapat disabunkan dengan merefluks selama 1-2 jam dengan larutan
kalium hidroksida 6% dalam etanol 95% yang banyaknya sekitar lima kali bobot
trigliserida. Untuk hidrolisis secara sempurna malam ester rantai-panjang
memerlukan kondisi yang lebih drastik - misalnya merefluks selama 12 jam
larutan dalam benzena ditambah volum yang sama larutan KOH 10% dalam alkohol.
Perbedaan dalam derajat kemudahan hidrolisis ini memungkinkan pemisahan
beberapa trigliserida dari malam ester dengan penyabunan tanpa terlalu banyak
malam yang hilang. Bahaya utama yang harus diperhatikan
pada penyabunan ialah bahwa pemanasan yang terlalu lama dapat menimbulkan
perubahan isomer pada letak ikatan rangkap dua dalam asam nekatakjenuh. Kadang-kadang
disarankan agar lesitin dihidrolisis dengan membiarkannya dengan kalium
hidroksida 1M pada suhu 37°C selama 16 jam.
Setelah hidrolisis, alkohol rantai panjang yang
terbentuk karena penyabunan malam ester dapat dipisahkan (bersama-sama dengan
bahan yang tidak tersabunkan) dengan ekstraksi memakai benzena dan sebagainya.
Kemudian campuran sisa ekstraksi diasamkan dan asam lemak diekstraksi dengan
eter. Campuran asam lemak rantai panjang, baik yang terdapat di alam maupun yang berasal
dari penyabunan dapat dipisahkan dengan berbagai tata kerja penghabluran dan
distilasi. Cara yang biasa ialah melarutkan asam lemak dalam aseton dan
didinginkan pada -60° sampai -70°C. Asam takjenuh tetap larut sementara yang
lain menghablur. Dengan melarutkan kembali endapan dan menghablurkan kembali
pada -30° sampai -40°C sebagian besar asam tak jenuh yang mempunyai satu ikatan
rangkap dua tetap dalam larutan. Penghabluran ulang terakhir dari eter pada
-30°C mengendapkan sebagian besar asam jenuh. Pemisahan ini tidak sempurna,
tetapi dengan pengulangan dan penggabungan dengan metode lain, fraksinasi yang
memuaskan biasanya dapat dicapai menurut derajat ketidakjenuhan. Pemisahan
jenis lain mengandalkan kelarutan bertingkat garam timbal dalam alkohol.
Fraksinasi lebih lanjut dapat dicapai dengan distilasi ester metil asam pada
tekanan rendah (0,1-0,5 mm Hg).
Pemurnian lipid secara kromatografi mempunyai
banyak keuntungan ketimbang metode fraksinasi memakai pelarut meskipun
fraksinasi pendahuluan memakai pelarut mungkin diperlukan untuk campuran yang
rumit. Kromatografi memakai
asam silikat terutama,
berguna untuk lipid anion karena lipid yang kurang polar bergerak melalui kolom
dengan cepat. Jadi fosfolipid dapat
dipisahkan dengan mudah dari lipid lain, dan kemudian dipisah-pisah lagi.
Contoh tata kerja
ialah membuat bubur silika gel dengan kloroform-metanol 2:1, tambahkan larutan
lipid dalam kloroform, dan mulai elusi dengan kloroform saja. Ketika lipid
nonpolar bergerak melalui kolom, konsentrasi metanol dalam pengelusi dinaikkan
sedikit demi sedikit. Akhirnya senyawa yang paling polar dielusi dengan metanol
murni. Triasilgliserol dapat dipisahkan menjadi komponen-komponen campuran yang
berbeda derajat ketidakjenuhannya dengan memakai kolom ion logam-terikat (104).
Kromatografi pertukaran ion dengan berbagai jenis kemasan kolom berguna dalam
isolasi fosfolipid dan sulfolipid dan dalam pemisahan sulfolipid dari
fosfolipid. Kromatografi fase balik memberikan urutan elusi yang berlawanan
dengan urutan pada kromatografi memakai asam silikat.
Puncak elusi sering dapat dikenali dengan mengukur serapan
pada 300 nm. Serapan ini diberikan oleh hasil oksidasi asam lemak tak jenuh
jika kita tidak mengusir oksigen dari lingkungan dengan baik. Cara lain untuk
mengidentifikasi fraksi eluat yang mengandung lipid ialah dengan menotolkan sedikit
pada pelat ferotipe. Ketika pelarut yang atsiri menguap, lipid yang sedikit dapat
terlihat dengan mudah.
f.
SENYAWA
AKTIF MINYAK ATSIRI
Komponen minyak atsiri buah dan bunga
terdapat dalam jumlah yang sangat kecil sehingga diperlukan bahan awal yang sangat
besar jumlahnya untuk mengisolasi senyawa yang memadai untuk diteliti. Oleh
karena keatsiriannya, senyawa ini sukar pula diisolasi dan sering seluruhnya
diubah menjadi turunan yang tidak atsiri yang selanjutnya dapat difraksinasi.
Ada
tiga cara umum untuk mengambil komponen atsiri dari tumbuhan:
1) Distilasi
pada suhu kamar dapat menimbulkan peruraian, sedangkan pada tekanan rendah dan
suhu rendah memungkinkan terjadinya penguraian oleh enzim, sehingga menimbulkan
perubahan kandungan jaringan. Jika reaksi
oksidasi menimbulkan masalah, distilasi dapat dilakukan dalam lingkungan
nitrogen.
2) Ekstraksi
dengan pelarut dapat dilakukan pada keadaan khusus terutama untuk senyawa yang
tidak begitu polar. Beberapa senyawa atsiri yang berbobot molekul rendah terlalu
mudah larut dalam air untuk diekstraksi dengan pelarut organic secara efisien.
3) Proses
aerasi hanya yang dikeluarkan ke udara saja yang terisolasi dengan mengalirkan
udara melalui bahan tumbuhan untuk jangka waktu lama dan mengembunkan senyawa
yang terbawa udara dalam penampung yang didinginkan atau menjerapnya memakai
bahan yang hidrofob. Cara lain ialah mengalirkan uap yang terbawa udara melalui
pereaksi yang sekurang-kurangnya bereaksi dengan beberapa komponen menghasilkan
turunan yang tak atsiri.
Campuran senyawa atsiri yang diisolasi
dengan salah satu cara di atas dapat
difraksinasi dengan cara destilasi atau kromatografi. Pemisahan secara
kromatografi dapat dilakukan memakai kolom partisi cair atau kromatografi gas.
Cara lain, turunan komponen campuran dapat digunakan untuk memisahkannya. Jadi,
aldehid dan metilketon membentuk senyawa bisulfate yang tidak larut dalam air
dan dapat dipisahkan dari senyawa lain dalam ekstrak organik dengan cara
melewatkan ekstrak melalui kolom bisulfit. Senyawa ini dapat pula diubah
menjadi senyawa 2,4-dinitrofenilhidrazon yang berbentuk padat, dan senyawa
atsiri lainnya didestilasi. Aldehide membentuk turunan yang tidak larut dalam
air dengan dimedon. Keton tidak bereaksi dengan pereksi ini. Alkohol dapat
diubah menjadi uretan yang padat dengan mereaksikannya dengan isosianat atau
menjadi 3,5-dinitrobenzoat dengan merekasikannya dengan 3,5-dinitrobenzoil
klorida. Kemudian senyawa atsiri lainnya dipisahkan dengan cara penyulingan.
Ester tidak dapat dipisahkan sebagai ester dengan cara kimia karena turunannya
bagian alcohol atau bagian asam dari ester bukan ester utuh.
g. SENYAWA AKTIF TERPENOID DAN STEROID
Jika diperhatikan struktur senyawa
terpenoid dan steroid yang sangat beragam jelas bahwa tidak ada metode isolasi
umum yang dapat diapaki untuk semuanya. Akan tetapi, sebagian besar jelas
senyawa nonpolar dank arena itu dapat dipisahkan dari komponen tumbuhan yang
polar dengan mengekstraksi menggunakan pelarut seperti bezen atau eter.
Karbondioksida superkritis merupakan pengekstraksi yang berguna, tidak merusak
dan mudah disingkirkan dengan penyabunan memakai basa dalam alkohol dilanjutkan
dengan ekstraksi memakai eter. Asam dan alkohol berbobot molekul rendah tetap
berada dalam fase basa sementara sebagian besar terpenoid dan steroid
terekstraksi dengan eter bersama-sama dengan alcohol berbobot molekul tinggi,
hidrokarbon nonterpenoid dan sebagainya. Pengenceran ekstrak methanol/kloroform
dengan air menyebabkan sterol tetap berada dalam lapisan kloroform sedangkan
triterpenoid netral dan asam mengendap. Pemakaian aseton pada ekstraksi dapat
menimbulkan senyawa jadian karena kondensasi.
Patut diperhatikan bahwa dalam tata
kerja umum ini ada perkecualian. Senyawa glikosida seperti saponin dan
glikosida jantung tida larut dalam pelarut non polar. Senyawa ini paling cocok
diekstraksi dari tumbuhan memakai etanol
atau methanol panas 70-95% dan kemudian lipid dan pigmen disingkirkan dari
larutan ini dengan ekstraksi memakai benzene atau dengan pengendapan memakai
timbale hidroksida. Urutan ekstraksi dapat juga dibalik, artinya lipid
diekstrkasi lebih dahulu dengan eter atau benzene dan kemudian glikosida
diekstraksi dengan alkohol panas. Beberapa glikosida akan mengendap jika
larutan alkohol panas ini didinginkan, dan hal ini membantu pemisahan.
Terpenoid asam, jika terdapat sebagai asam bebas, larut dalam pelarut nonpolar
tetapi pada penyabunan akan amsuk ke dalam fasa basa. Alkaloid terpenoid dan
steroid tentu saja berperilaku seperti alkaloid lainnya, lebih mudah larut dalam
pelarut nonpolar dalam suasana basa daripada dalam suasana asam.
Metode
pemurnian khusus dapat dipakai untuk berbagai kelompok senyawa. Terpena
berbobot molekul rendah biasanya dipisahkan dengan penyulingan sederhana atau
penyulingan uap. Senyawa atsiri yang dilepas oleh tumbuhan dapat dijerap dari
udara yang dialirkan melaluinya dan kemudian dielusi dari penjerap. Kemungkinan
besar pencemar nonterpenoid ialah ester atsiri yang dapat disingkirkan dengan
penyabunan. Pada pemurnian karotenoid penyabunan pencemar dilakukan tanpa
pemanasan untuk mencegah penguraian. Karotenoid dapat dipisahkan dengan
berdasarkan kelarutannya. Apa yang disebut karotenoid epifase lebih mudah larut
dalam lapisan eter minyak bumi jika dikocok dengan campuran eter minyak bumi
dan methanol. Karotenoid hipofase ialah karotenoid yang mengandung dua gugus
hidroksi atau lebih. Karotenoid hipofase lebih mudah larut dalam lapisan
methanol. Beberapa senyawa monohidroksi dijumpai dalam kedua lapisan.
Pembentukan
senyawa kompleks digunakan pada pemurnian beberapa senyawa golongan ini.
Tiourea membentuk senyawa adisi, disebut aduk, dengan banyak jenis rantai
hidrokarbon bercabang, bergantung pada ukuran molekulnya. Beberapa senyawa
siklik dapat pula bereaksi. Aduk tiourea tidak larut dalam alkohol dan pelarut
non polar. Senyawa adisi ini dapat dibuat dengan mencampur larutan tiourea
dalam alkohol dan cuplikan untuk mengendapkan aduk, atau bahan kering digerus
dengan tiourea dan sedikit methanol. Jika aduk sudah terbentuk, lipid yang
tidak bereaksi diekstraksi dengan benzene, eter dan sebagainya. Kemudian aduk
tiourea diuraikan dengan air panas dan senyawa yang diinginkan diekstraksi
dengan eter. Senyawa alifatik rantai lurus dapat dipisahkan dari terpenoid
bercabang atau siklik dengan mengubah senyawa rantai lurus menjadi kompleks
urea.
Pembentukan
senyawa kompleks sangat lazim juga pada berbagai senyawa steroid. Gejala ini
menimbulkan kesulitan pada pemurnian, tetapi dapat pula dimanfaatkan. Terutama
digitonin sering dipakai untuk mengendapkan sterol dari larutan dalam alkohol
sebagai digitonida yang tidak larut. Reaksi ini khas untuk sterol 3β-OH. Kemudian sterol bebas dapat
diperoleh kembali dengan mempartisi senyawa kompleks antara air panas dan
benzene atau xilena, saponin terdapat dalam lapisan air dan sterol dalam
lapisan organik. Cara lain untuk menguraikan senyawa kompleks ialah dengan
mendidihkannya dalam piridin, didinginkan lalu ditambah eter untuk mengendapkan
saponin dan sterol yang tetap larut. Sebaliknya, cara ini dapat dipakai untuk
memurnikan banyak saponin dengan menambahkan kolesterol agar terbentuk senyawa
kompleks adisi yang tidak larut.
Pemurnian
lebih lanjut biasanya dilakukan memakai kromatografi kolom sebagai cara umum,
meskipun cara khusus untuk masing-masing senyawa ada (misalnya penyulingan
bertingkat untuk terpenoid berbobot molekul rendah). Pemurnian saponin,
kardenolida dan glikosida lain sulit tetapi dapat dilakukan dengan memakai
beberapa jenis kromatografi. Senyawa ini biasanya dihidrolisis dahulu menjadi
aglikonnya dengan mendidihkannya beberapa jam dalam HCl 1-4 M, aglikon
diekstraksi dengan benzene dan dimurnikan dengan kromatografi memakai alumina
dan pelarut pengembang nonpolar seperti eter minyak bumi, benzene dan
sebagainya. Secara umum alumina yang sangat aktif tidak diinginkan karena dapat
menimbulkan reaksi penguraian. Alumina aktif dapat dinetralkan dengan asam dan
ditambah air beberapa persen untuk menurunkan aktivitasnya. Filtrasi gel dan
kolom fase balik telah dipakai juga. Sterol dapat diubah menjadi uretan yang
berwarna untuk membantu penampakan pemisahannya pada kolom florisil. Setelah
dipisahkan, sterol asal dapat diperoleh kembali secara kuantitatif. Beberapa
karotenoid terlalu peka untuk kromatografi meskipun memakai alumina yang
diawaaktifkan, dan dianjurkan penjerap yang lebih lunak seperti magnesium
oksida dan sakarosa. Kromatografi lawan-arus tetes telah digunakan untuk
apokarotenoid. Karotenoid dapat dipisahkan dari steroid dengan cara
kromatografi memakai dekstran lipofil. Penjerap lazim lain seperti kalsium
karbonat dan silica gel telah dipakai untuk beberapa terpenoid, glikosida
jantung dan sebagainya.
h. SENYAWA AKTIF FLAVONOID DAN SENYAWA SEJENIS
Banyak senyawa dari golongan ini mudah
larut dalam air, terutama bentuk glikosidanya dan oleh karena itu senyawa ini
berada dalam ekstrak air tumbuhan. Bahkan senyawa yang hanya larut sedikit
dalam air kepolarannya memadai untuk diekstraksi dengan baik memakai methanol,
etanol atau aseton dan methanol 80% barangkali merupakan pelarut yang sering
dipakai untuk ekstraksi flavonoid. Pengekstraksian kembali larutan dalam air
dengan pelarut organik yang tidak bercampur dengan air tetapi agak polar
seperti karbohidrat. Etil asetat merupakan pelarut yang baik untuk menangani
katekin dan proantosianidin dengan cara ini. Benzena dapat dipakai untuk
benzofenon dan stilbena. Amil alkohol telah dipakai secara luas untuk
antosianin. Butil alkohol sekunder adalah alkohol yang paling polar yang
bercampur dengan air secara tidak sempurna, dan jika ekstrak air dijenuhkan
dengan natrium klorida atau magnesium sulfat, pelarut ini sangat baik untuk
mengekstraksi senyawa golongan ini. Senyawa polifenol seperti ini sangat peka
terhadap oksidasi udara dalam larutan netral atau basa, oleh karena itu
dinajurkan untuk membuat ekstrak memakai asam encer (misalnya HCl 0,1M) dan
senyawa pereduksi seperti asam askorbat. Akan tetapi, asam panas atau jika
dibiarkan lama dengan asam pada keadaan dingin dapat menyebabkan terjadinya
hidrolisis glikosida dan ester malonil. Tanin dapat dibebaskan dari ikatannya
yang kuat pada protein dengan mengekstraksi protein memakai fenol.
Dari segi analisis masa lampau, berbagai
pereaksi pengendap telah digunakan untuk senyawa ini. Timbal asetat netral atau
basa terutama dianjurkan. Flavonoid dapat dibebaskan dari endapan timbale
dengan menambahkan asam sulfat encer atau hydrogen sulfide, timbale mengendap
sebagai timbale sulfat atau timbal sulfide. Pereaksi pengendap lainnya ialah
asam pikrat, kalium asetat, barium hidroksida, piridina, iterbium asetat dan
sebagainya.
Kromatografi partisi kolom telah
digunakan untuk memisahkan senyawa ini, misalnya kolom magnesol atau asam
silikat dengan pengelusi etil asetat yang dijenuhkan dengan air atau eter.
Alumina terutama berguna dalam pemisahan antosianin yang hanya mempunyai satu
gugus hidroksil bebas pada cincin B dari antosianin yang mengandung dua atau
lebih gugus itu. Kolom partisi memakai serbuk selulosa telah digunakan untuk
berbagai polifenol, termasuk antosianin. Kromatografi pertukaran ion berguna
untuk beberapa jenis struktur, tetapi gaya nonion berperan penting pada
pengikatan senyawa aromatic ini ke dammar penukar berdasar polistirena. Gaya
nonion ini dimanfaatkan dalam kromatografi fase balik dengan penjerap hidrofob.
Kolom tersebut telah digunakan untuk berbagai flavonoid. Kromatografi afinitas
pada protein Sepharose memisahkan polimer. Beberapa peneliti menganjurkan
pemakaian kolom poliamida untuk memurnikan flavonoid. Penjerapan pada
polivinilpirolidon atau dekstran lipofil efektif untuk isolasi antosianin dan
proantosianidin secara bertahap. Kromatografi lawan arus telah digunakan untuk
beberapa jenis flavonoid yang berbeda termasuk polimer berbobot molekul tinggi.
i.
SENYAWA
AKTIF ASAM AMINO
Sebelum ada kromatografi pertukaran ion
dan kromatografi partisi, kebanyakan asam amino diisolasi dari hidrolisat
protein khusus atau dari asam amino yang terdapat dalam jaringan tumbuhan atau
hewan tertentu. Jadi, asparagin, asam amino pertama yang diisolasi dari alam
diperoleh dengan memekatkan sari asparagus. Asam aspartat dapat dibuat dari
asparagin dengan cara hidrolisis dalam suasana asam. Asam glutamat diperoleh
dari hidrosilat asam gluten gandum. Isoleusina diisolasi dari moalse bit gula.
Fenilalanin dan argini diisolasi dari kecambah Lupinus sp. Yang dietiolasi.
Asam amino umum yang alin kebanyakan dapat diisolasi dengan mudah dari sumber
hewan.
Isolasi asam amino tumbuhan yang lebih
baru umumnya memerlukan cara yang lebih canggih, karena senyawa ini terdapat
dalam cairan sel berasma-sama dengan sejumlah besar kandungan sel yang lain dan
seringkali hanya terdapat dalam jumlah kecil. Sebagai tata kerja awal,
pertukaran ion dapat dipakai untuk memekatkan asam amino, menghilangkan
pencemar netral, dan pengelompokkan asam amino ke dalam fraksi netral, asam dan
basa. Setelah mengerjakan tahap pemekatan pendahuluan dan pemurnian, mungkin
masih perlu memisahkan memisahkan asam amino yang dikehendaki dari sejumlah
senyawa yang erat kaitannya. Untuk itu kromatografi pertukaran ion dapat diatur
peubah seperti pH dan suhu.
j.
SENYAWA
AKTIF PEPTIDA DAN PROTEIN
Isolasi peptide biasanya dapat dilakukan
dengan cara yang sama seperti yang dipakai untuk isolasi asam amino. Pemurnian
pendahuluan dapat dilakukan memakai catridge fase balik dan golongan peptida
dapat dipisahkan dari asam amino dengan memanfaatkan perbedaan sifat senyawa
kompleksnya dengan tembaga. Kromatografi cair fase balik, eksklusi ukuran
molekul dan cara kromatografi pertukaran ion telah dipakai untuk banyak jenis
peptida. Pada kromatografi eksklusi ukuran, peptida sering berperilaku secara
nonideal karena adanya antaraksi hidrofob dengan kemasan kolom, tetapi
pemakaian asetonitril yang mengandung air dan asam trifluoroasetat 0,1% dapat
membantu mengatasi masalah ini. Deteksi peptida dalam efluen kolom dapat dilakukan
dengan mengukur serapan pada panjang gelombang 200-220 nm atau dengan
mereaksikannya dengan fluoresamina. Di samping kromatografi kolom biasa,
kromatografi lawan arus dapat dipakai juga untuk peptide kecil. Untuk
mengawagaraman peptida yang berbobot molekul lebih kecil dari 3500 proses
dialysis, ultrafiltrasi, filatrasi gel dapat menyebabkan kehilangan yang
merugikan, dank arena itu yang dipakai metode kerja yang khusus.
Yang perlu diperhatikan metode kerja
yang digunakan adalah kondisi yang tidak menimbulkan denatuarsi protein. Pada
umumnya dianjurkan untuk bekerja pada suhu rendah dan menghindari rentang pH
yang ekstrem. Ekstraksi jaringan yang dibekukan dengan es kering atau nitrogen
cair mencegah penguraian. Pemilihan pelarut ekstraksi awal sangat penting pada
penyiapan protein tumbuhan. Dapar basa mengekstraksi lebih banyak protein dalam
bentuk terlarut dan membantu menetralkan cairan bersifat asam. Masalah yang
sering dijumpai pada isolasi protein asli (terutama enzim) dari tumbuhan
disebabkan oleh adanya senyawa fenol yang membentuk senyawa kompleks dengan
protein dan mungkin mengawaaktifkan enzim. Fenol polimer yang dioksidasi
(tanin) lebih buruk daripada fenol sederhana. Pengompleksan ini bergantung pada
ikatan hidrogen dan antaraksi hidrofob. Pendekatan menghadapi masalah ini ialah
menghambat oksidasi fenol sederhana menjadi polimer dengan menambahkan senyawa
seperti 2-merkaptoetanol, tiourea, atau natrium metabisulfit. Pendekatan lain
ialah menambahkan bahan yang cenderung lebih mengikat fenol. Penambahan senyawa
polihidroksi mungkin juga bermanfaat untuk mencegah agregasi dan pengendapan
protein.
Ekstraksi protein dari jaringan berlemak
dilakukan setelah lipid dihilangkan dengan ekstraksi memakai memakai eter dan
aseton. Setelah itu diekstraksi berturut-turut dengan memakai etanol 70%, air,
natrium klorida 10%, dan natrium hidroksida 0,2%. Fraksinasi ekstrak ini dapat
dilakukan dengan cara mengotak-atik pH dan kekuatan ion lebih lanjut.
Pengendapan dengan ammonium sulfat atau pelarut organik sering digunakan. Jika
cara yang nisbi sederhana ternyata tidak memuaskan untuk memperoleh protein
murni dari campuran, maka dapat dipilih cara yang lebih canggih. Filtrasi gel
memakai dekstran atau gel poliakrilamida merupakan langkah awal yang cocok. Filtrasi
gel pada lapisan tipis dapat pula disesuaikan untuk pemisahan preparative.
Kromatografi pertukaran ion protein dilakukan memakai selulosa atau dekstran
penukar ion.
k. SENYAWA AKTIF ALKALOID
Alkaloid biasanya diperoleh dengan cara
mengekstraksi bahan tumbuhan memakai air yang diasamkan yang melarutkan
alkaloid sebagai garam, atau bahan tumbuhan dapat dibasakan dengan natrium
karbonat dan sebagainya dan basa bebas diekstraksi dengan pelarut organic
seperti kloroform, eter dan sebagainya. Beberapa alkaloid yang dapat menguap
seperti nikotina dapat dimurnikan dengan cara penyulingan uap dari larutan yang
dibasakan. Larutan dalam air yang bersifat asam dan mengandung alkaloid dapat
dibasakan dan alkaloid diekstraksi dengan pelarut organik sehingga senyawa netral
dan asa, yang mudah larut dalam air tertinggal dalam air. Kemudian alkaloid
dielusi dengan basa encer. Alkaloid yang bersifat cukup hidrofob dapat dijerap
dengan dammar lalu dielusi dengan asam atau campuran etanol air (39:40). Banyak
alkaloid yang dapat diendapkan dengan pereaksi Mayer (kalium raksa (II) iodide)
dan kemudian endapan dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya dengan cara
kromatografi pertukaran ion.
Masalah yang timbul pada beberapa kasus
ialah bahwa alkaloid berada dalam bentuk terikat yang tidak dapat dibebaskan
pada kondisi ekstraksi biasa. Senyawa pengompleksnya barangkali polisakarida
atau glikoprotein yang dapat melepaskan alkaloid jika diperlakukan dengan asam.
Cara paling umum dan cocok adalah memisahkan dengan kromatografi kolom memakai
dammar penukar ion atau penjerap dengan menggunakan alumina atau menggunakan
kromatografi kertas.
