pertemuan6,7,8

BAB III

KROMATOGRAFI

PENDAHULUAN

               

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan dan kromatografi preparative hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan juga diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan) dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian).

                Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah: Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC), dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisah. KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air (karbohidrat, asam amino, dan senyawa fenolat), KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut lipid (lipid, steroid, karotenoid, dan klorofil), KGC penggunaannya terutama untuk minyak atsiri (asam lemak, mono- dan seskuiterpen, hidrokarbon, dan senyawa belerang), cara lain yaitu KCKT, dapat memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan keefisien kolom dan kecepatan metode analisis.

METODE ISOLASI

               

Metode pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik atau gabungan teknik tersebut.

Kromatografi dapat digolongkan :

Berdasarkan sifat-sifat dari fasa tetap :

1.     Berupa zat padat  (Kromatografi serapan (Adsorption Chromatography )

2.     Berupa zat cair (Kromatografi partisi ( Partition Chromatography )

Berdasarkan fasa gerak yang dapat berupa zat cair atau gas maka ada empat macam sistem kromatografi :

1.     Fasa gerak zat cair, fasa tetap padat :

Dikenal sebagai kromatografi serapan yang meliputi :

-  Kromatografi Lapis Tipis : KLT : TLC

-  Kromatografi Penukar Ion : IEC :Ion Exchange Chromatography

2.     Fasa gerak gas, fasa tetap padat :

Kromatografi Gas Padat : GSC : Gas Solid Chromatography

3.     Fasa gerak zat cair, fasa tetap zat cair :

Dikenal sebagai Kromatografi Partisi

Kromatografi Kertas : K Kt : PC : Paper Chromatography

4.     Fasa gerak gas, fasa tetap cair :

Kromatografi Gas-Cair : GLC : Gas Liquid Chromatography

Kromatografi Kolom Kapiler

PRINSIP UMUM

1.     Pola elusi kromatografi

Sejumlah sampel yang dilarutkan dalam fasa gerak, dituangkan pada puncak kolom atau awal elusi, dengan segera terdistribusi diantara kedua fasa gerak dan fase diam. Dengan tambahan fasa gerak (eluen), solven yang mengandung sebagian dari sampel akan terdesak ke bagian fase diam atau kolom yang lebih bawah, dan akan terjadi distribusi baru antara fasa gerak dan fasa diam baru.

Dalam waktu yang bersamaan, distribusi baru juga terjadi pada puncak kolom atau dari awal penotolan antara fasa gerak baru dengan fasa diam yang telah mengandung sebagian sampel. Karena solut hanya dapat bergerak dengan fasa gerak, rata-rata kecepatan migrasi solut tergantung pada fraksi waktu pada saat solut berada dalam fasa gerak. Apabila solut mengalami retensi pada fasa diam, fraksi waktu ini akan lebih kecil bila dibandingkan terhadap solut yang tidak mengalami retensi. Perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing solut dalam campuran menyebabkan terjadinya pemisahan campuran menjadi pita-pita solut sepanjang kolom atau noda sepanjang fase diam.

Proses terbawanya solut dari puncak kolom atau awal penotolan  sampai akhir kolom atau akhir perjalanan eluen disebut Elusi.

2.     Koefisien partisi atau konstanta distribusi

                Apabila  solut masuk dalam sistem kromatografi, segera akan terdistribusi diantara fasa diam dan fasa gerak. Bila alir fasa gerak dihentikan, akan terjadi keseimbangan diantara kedua fasa, dan perbandingan konsentrasi pada tiap fasa dapat digambarkan sebagai Koefisien Partisi ( K ) :

Cs

K = ────

Cm

 

Koefisien partisi ini disebut juga Konstanta Distribusi. Cs dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fasa diam dan fasa gerak. Koefisien partisi menggambarkan kecepatan rata-rata tiap solut pada waktu fasa gerak bergerak ke ujung kolom. Pada keadaan ideal, harga rasio partisi konstan untuk kisaran konsentrasi yang luas, sehingga Cs proporsional terhadap Cm  dan korelasi antara keduanya membentuk kurva garis lurus.

 Bila harga K besar berarti populasi dalam fasa diam lebih besar daripada populasi dalam fasa gerak, sehingga rata-rata molekul menghabiskan waktunya lebih lama di dalam fasa diam.

3.     Retensi solut

                Retensi menunjukkan adanya distribusi solut antara fasa gerak dan fasa diam. Volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk membawa pita solute dari titik injeksi / permulaan kolom, melalui kolom, didefinisikan sebagai Volume Retensi ( retention volume = VR ).

                                VR = tR. Fc

                tR  adalah waktu retensi, Fc adalah kecepatan alir volumetric yang dinyatakan dengan volume fasa gerak persatuan waktu.

4.    Rasio partisi atau faktor kapasitas

                      Rasio kapasitas didefinisikan sebagai rasio jumlah solut dalam fasa diam terhadap jumlah solut dalam fasa gerak.

                                         Cs Vs                    Vs

                                K’ = ------- = K  ----

CMVM              VM

Rasio kapasitas juga dapat dinyatakan sebagai rasio waktu yang dibutuhkan untuk elusi solut dalam kolom terhadap waktu yang dibutuhkan untuk elusi solut tak ditahan kolom.

Jika harga K’ > 10, membutuhkan waktu analisis yang lama, sedangkan bila harga K’ < 1, solut yang segera terelusi keluar kolom, tidak terpisah.

                      Fraksi waktu tinggal solut dalam suatu fasa hampir sama bagi seluruh molekul solut yang pada waktu itu berada bersamaan dalam salah satu fasa, oleh karena itu rata-rata fraksi waktu tinggal solut dalam fasa gerak :

                         CM VM                        1

                -------------- = -------

                 CM VM + Cs Vs          1 + K’

        Sedangkan waktu tinggal solut dalam fasa diam :

                         Cs Vs                            K’

                -------------- = -------

                 CM VM + Cs Vs          1 + K’

       

5.    Retensi relatif

                      Retensi relatif ( a ) antara dua solut, solut 1 yang terelusi sebelum solut 2, dapat dinyatakan  dengan berbagai tetapan

                                         V’ R,2           t’ R,2

                                a =  ------ = -----

                                         V’ R,1           t’ R,1

                                        VR,2  - VM,2               tR,2  - tM,2

                                     = ----------- = ----------

                                       VR,1  - VM,1                  tR,1  - tM,1

                               

Retensi relatif  tergantung pada :

a.    sifat fasa gerak dan fasa diam

b.    temperatur kolom pada waktu bekerja

Kekuatan elusi pelarut pada silika dan polaritas pelarut

—  Totolan bercak sekecil mungkin —  Biasanya 1- 2 mm, totolan besar: bercak menyebar dan bertumpuk —  Digunakan pelarut sampel yang bisa melarutkan sampel dengan baik, tetapi mudah menguap dan daya elusinya kecil —  Secara manual/otomatis —  Dapat digunakan pipa kapiler, mikropipet, mikrosiring

Aplikasi sampel

       

1.    KROMATOGRAFI KERTAS

Pada kromatografi kertas sistem partisi sebagai fasa pendukung dipakai kertas saring biasa atau kertas Whatman. Jadi faktor yang bekerja pada kromatografi kertas adalah pembagian/partisi antara fasa stasioner yang terdiri dari kompleks air-selulosa dan fasa mobil (cairan penghantar). Pada kromatogarfi kertas, serat-serat selulosa mempunyai afinitas yang kuat terhadap air, maka air akan diikat sebagai fasa stasioner. Fasa mobil akan mengalir melalui kertas yang mengandung zat tersebut; maka akan terjadi pembagian zat itu antara fasa mobil dengan fasa stasionernya. Dalam pengalirannya bila fasa mobil tiba pada kertas/bagian kertas yang tidak/belum mengandung zat, maka akan terjadi pembagian; yaitu pembagian zat yang terlarut dalam pelarut organik (fasa mobil) akan pindah ke fasa stasioner. Proses ini berlangsung terus-menerus selama fasa mobil mengalir, sehingga akan terjadi perpindahan zat dari titik asalnya ke suatu titik tertentu menurut arah pengaliran fasa mobil. Dengan demikian akan terjadi pemisahan dari zatnya. Supaya terdapat pembagian yang ideal, maka harus memenuhi syarat :

a.    zat yang melarut tidak boleh teradsorpsi oleh fasa pendukung.

b.    koefisien pembagian zat itu tidak boleh dipengaruhi oleh konsentrasinya atau adanya zat-zat lain.

Analisis pembagian secara kromatografi kertas secara singkat dilakukan sebagai berikut :

-  Campuran zat yang akan diperiksa dilarutkan dalam pelarut (sebaiknya yang mudah menguap)

-  Larutan zat itu diteteskan pada kertas

-  Elusi dalam kolom dan sesudah kering difiksasi / dicelupkan dengan suatu pereaksi tertentu ataupun secara fisika.

Cara melakukan perhitungan harga Rf:

Pembagian kromatografi kertas

Berdasarkan dimensinya : satu dimensi dan dua dimensi

Berdasarkan jalannya elusi :  * cara menaik

* cara menurun

* cara mendatar / sirkuler

1.    Kromatografi Kertas Menaik ( Ascending Methods )

a.    Satu dimensi

Cara ini paling banyak dipakai dalam praktek. Kita ambil kertas saring/Whatman panjang ± 30 cm lebar 5 – 6 cm. Pada jarak 2,5 – 3 cm dari ujung bawah dibuat garis dengan pensil. Pada jarak 2 cm ditotolkan zatnya dengan pipa kapiler dimana ø tak boleh > 3 mm. Elusi dalam kolom tertutup (yang telah dijenuhkan) dengan zat pengelusi tertentu sampai batas permukaan tertentu ( ¾ x panjang kertas). Keringkan, fiksasi/ dengan sinar UV.

Kebaikan :

Untuk pemeriksaan pendahuluan dapat dicobakan dengan memakai tabung yang kecil dan untuk menjenuhkan diperlukan waktu yang relatif singkat.

Keburukan :

Larutan elusi kadang-kadang hanya dapat naik sampai 25 cm, karena gravitasi bumi, dimana kadang-kadang kita memerlukan jarak > 25 cm, sebab harga Rf dua zat yang hampir bersamaan akan terdapat noda-noda yang belum terpisah betul, maka dilakukan lebih lanjut dengan kromatografi dua dimensi.

b.    Dua dimensi

Digunakan bila dengan cara satu dimensi pemisahan zat tidak sempurna karena harga Rf dari zat-zat itu hampir sama nilainya.

Banyak dipakai untuk asam-asam amino yang difiksasi dengan ninhidrin.

Pada kromatografi menurun dari dua zat yang berdekatan ( Rfnya) mungkin masih dapat dipisahkan dengan mengelusi terus, tetapi pada cara menaik hal ini tidak mungkin tercapai karena jarak yang ditempuh oleh zat cair penghantar dibatasi oleh gaya gravitasi bumi.

Dalam hal demikian untuk memisahkan campuran dapat digunakan Kromatografi Dua Dimensi, elusi dilakukan dua kali berturut-turut. Arah elusi kedua diambil tegak lurus pada arah elusi pertama, sedangkan zat cair penghantar untuk kedua elusi tidak sama satu sama lain.

Misal : Campuran yang hendak dipisahkan ( A+B+C ) ditotolkan pada tempat x. Elusi dengan zat penghantar EI → didapat komponen A dan B yang belum terpisah karena harga Rf yang berdekatan dengan eluen ini, sedangkan C sudah terpisah sempurna. Maka dielusi sekali lagi dengan zat cair penghantar EII  (eluen II). Supaya terpisah A dari B harus dipisahkan sedemikian rupa eluennya sehingga harga Rf A tidak berdekatan dengan Rf zat B.

2.    Kromatografi Kertas Menurun ( Descending Method )

Prinsip sama dengan kromatografi menurun, hanya larutan elusi dijalankan dari atas ke bawah dengan alat khusus.

                                                               

3.    Kromatogarfi Kertas Mendatar / Sirkuler

Dengan cara ini dipakai suatu kertas yang bulat dan ditengahnya diberi lubang tempat untuk meletakkan sumbu yang terbuat dari gulungan kertas dimana melalui ini pelarut dapat naik, yang kemudian membawa kertas, untuk kemudian mengembang melingkar membawa senyawa yang dipisahkan.

Kesukaran larutan eluen bergerak kurang cepat, untuk mengatasi ini larutan eluen diteteskan dari atas.

Menentukan noda :

·  bila dipakai satu pereaksi warna maka seluruh kertas disemprot

·  bila dipakai beberapa pereaksi, gunting menjadi beberapa sektor, masing-masing sektor disemprot dengan berbagai pereaksi

Kebaikan :

a.    Kerja cepat dan rapih, untuk kertas ø 20 cm dalam waktu 2 jam, kertas ø 32 cm dalam waktu 4 – 5 jam.

b.    Pemisahan zat-zat lebih jelas dari cara 1 dan 2.

c.     Dapat dipotong-potong menjadi sektor.

d.    Masing-masing pereaksi dapat dipakai sekaligus.

e.    Dapat untuk menentukan secara kuantitatif.

Fase Diam

Kertas terdiri dari serat-serat selulosa yang mengandung “kotoran” tergantung dari jenis kertasnya. Misalnya kotoran yang berupa ion logam ( Ca2+, Mg2+, Fe3+, Cu2+, dll ) Dapat mengganggu karena terjadi pertukaran ion. Kertas yang khusus dibuat untuk kromatografi telah mengalami proses-proses pemurnian, misalnya pencucian dengan HCl dan lain-lain untuk menghilangkan ion-ion logam. Adapula pada pembuatannya, kertas itu serat-serat selulosanya tersusun menurut arah tertentu. Pada kartas kromatografi sering tanda ( → ) untuk menunjukkan arah elusi. Elusi sebaiknya dilakukan menurut arah panah itu ( arah serat ) supaya diperoleh noda-noda yang lebih nyata.

Kertas kromatografi banyak jenisnya. Aliran pelarut (eluen) pada kertas pada suhu tertentu dipengaruhi oleh kerapatan atau ketebalan kertas.

Kertas antara lain mempengaruhi :

1.    baik tidaknya pemisahan

2.    jelas atau tidaknya noda

3.    pembentukan “ekor” noda

4.    kecepatan mengalir pelarutnya

5.    harga Rf

Kertas yang banyak dipakai adalah kertas Whatman. Kertas Whatman No. 4 mempunyai karakteristik mirip seperti no.1, tetapi memberikan efek dua kali lebih cepat. Kertas-kertas yang lebih tebal ( Whatman no.3 ) biasanya digunakan untuk pemisahan jumlah yang lebih besar, karena mereka dapat menempung lebih banyak “cuplikan” tanpa menaikkan area dari noda mula-mula.

Kertas disediakan dalam bermacam-macam standard, bulatan dan gulungan dan dalam bentuk tertentu. Harus disimpan di tempat jauh dari setiap sumber uap (terutama ammonia, yang mempunyai afinitas tinggi terhadap selulosa ) dan jangan ditempatkan pada tempat yang mempunyai perubahan kelembaban yang tinggi.

Karakteristik dari kertas-kertas kromatografi

Tipe Kertas	Kecepatan aliran
	Cepat	Sedang	Lambat
Kertas Tipis	No. 4 No.54 No.540	No.7 No.1	No.2 No.30
Kertas Tebal	No.31 No.17	No.3 No.3 mm

        Perbedaan antara jenis-jenis kertas terletak pada :

·      kerapatan serat-serat

·      kecepatan mengalir (flow rate) larutan elusi

·      tebal kertas

·      kehalusan permukaan

·      cara pembuatan dan pemurnian

Adanya kertas yang dipakai harus didapar (buffer) dulu untuk mendapatkan hasil yang lebih baik. Dapar / buffer yang biasa dipakai adalah :

1.    sitrat-fosfat pH 8 - 9  untuk barbital

2.    fosfat pH 8 dan borat pH 8

2.    Pelarut

Beberapa larutan elusi yang sering dipakai :

Golongan	Larutan Elusi
Sulfa-sulfa, asam-asam organik, fenol	Normal butanol         40 ml NH4OH                      10 ml Aqua                 ad   100 ml Kocok kuat-kuat dan diamkan beberapa jam, timbul 2 lapisan, ambil lapisan n-butanolnya yang jenuh dengan NH4OH Disebut Butanol/NH3/air
Asam-asam amino	* Fenol/air  larutan jenuh * n butanol/asam cuka/air    4 : 1 : 5 * n butanol/asam cuka/air  12 : 3 : 5 * n butanol/piridin/air            1 : 1 : 1
Alkaloida	Normal butanol             100 Asam cuka biang            10 Jenuhkan dengan air (penambahan air sedikit-sedikit sambil dikocok sampai tampak adanya lapisan air di bawah) Ambil bagian yang jernih
Karbohidrat	* etil asetat/piridin/air             2 : 1 : 2 * etil asetat/n propanol/air      6 : 1 : 3 * etil asetat/asam cuka/air      3 : 1 : 3
Asam-asam lemak	n butanol/1,5 M NH3          larutan jenuh
Fe, Cl, Br, I ( garam-garam Na )	Piridin/air                              90 : 10
Hg, Pb, Cd, Cu, Bi (klorida-klorida)	n butanol/3 M HCl             larutan jenuh

Larutan elusi pada kromatografi pembagian umumnya terdiri dari 2 fase, yaitu fasa air (stasioner) dan fasa mobil (pelarut organik). Pemilihan larutan elusi ditentukan oleh banyak faktor, terutama oleh kelarutan zat yang diperiksa dalam pelarut.

Perbandingan di atas menentukan harga Rf, makin besar perbedaan nilai tersebut makin baik pemisahan. Kecepatan mengalir larutan elusi juga berpengaruh. Umumnya larutan elusi yang lambat bergeraknya memberi noda-noda yang jelas.

Rf terutama sekali dipengaruhi oleh koefisien pembagian itu, selain itu dipengaruhi oleh temperatur / suhu, tekanan uap / kelembaban udara. Selama elusi ruang kromatografi harus jenuh uap larutan itu, maka sebelum elusi dimulai harus disediakan waktu untuk menjenuhkan ruangan itu dengan uap larutan elusi. Temperatur selama elusi harus konstan. Karena dalam praktek tidak selalu dapat diadakan pada keadaan-keadaan yang sudah ditentukan, seringkali digunakan zat pembanding untuk membantu identifikasi.

Syarat larutan elusi :

·      tidak boleh bereaksi dengan zat

·      harus cukup stabil, sehingga waktu penguraian tidak mengalami perubahan

·      mudah menguap sehingga kertas mudah dikeringkan

·      viskosita tidak selalu besar sehingga pengaliran tidak terlalu lama

Sedangkan kecepatan merambat elusi selain tergantung pada viskosita juga tergantung dari mutu kertas, berat jenis dan tegangan permukaan.

3.    Cara menyatakan noda ( pendeteksi )      

             Pada kromatografi dari zat yang tidak berwarna, maka tidak akan tampak dimana letak noda setelah dielusi, untuk mengetahui tempat nodanya dapat dipakai cara :

a.    Cara fisika

Untuk zat-zat yang berfluoresensi dapat dilihat di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm, dimana nantinya akan nampak bintik-bintik fluoresen.

b.    Cara kimia

Kromatogram dikerjakan dengan pereaksi warna sehingga nampak noda-noda berwarna.

c.     Cara mikrobiologi

Terutama untuk menyatakan antibiotika dan vitamin.

                Dengan pereaksi warna :

                Banyak sekali pereaksi warna yang dapat dipakai untuk maksud ini, yang perlu diperhatikan :

a.    Kekhasan ( spesifisitas )

Suatu pereaksi warna dapat memberi warna khas/spesifik dengan suatu warna tertentu. Tetapi banyak pula pereaksi yang memberi warna sama dengan segolongan zat, untuk ini identifikasi didasarkan atas harga Rf. Jadi secara umum untuk identifikasi suatu zat diperhatikan warna serta Rf nya.

b.    Kepekaan

Untuk kebanyakan reaksi warna, penggunaannya pada kertas mengurangi kepekaan. Tetapi sebaliknya ada pula kemungkinan bahwa warna yang diperoleh pada kertas lebih jelas dari warna pada reaksi tetes.

       

Cara mereaksikan :

a.    Dengan menyemprotkan ( spraying )

Dengan suatu alat penyemprot, pereaksi disemprotkan pada kromatogram. Pereaksi jangan terlalu berlebih karena dapat menyebabkan noda-noda kurang jelas kelihatan. Dianjurkan untuk memperhatikan pada bagian belakang dari kertasnya ( jadi bagian yang tidak langsung berhubungan dengan pereaksi ) karena seringkali memperlihatkan noda-noda yang lebih jelas.

b.    Dengan mencelupkan (dipping)

Kromatogram dicelupkan dalam larutan pereaksi dan didiamkan selama waktu tertentu.Cara ini hanya dapat dilakukan bila zat yang akan dinyatakan tidak larut dalam pereaksi tersebut. Sebelum direaksikan dengan pereaksi (warna), kromatogram dikeringkan dulu. Pengeringan dilakukan pada suhu kamar dan dapat juga dengan pemanasan setelah penambahan pereaksi, kadang-kadang perlu pemanasan lagi agar noda-noda kelihatan lebih jelas, misalnya mendeteksi asam amino dengan ninhidrin. Pada suhu kamar baru memberikan warna setelah kira-kira 24 jam. Tetapi pada pemanasan pada kira-kira 100 0C warna akan timbul setelah kira-kira empat menit.

2.    KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) adalah suatu cara pemisahan yang berdasar pada pembagian campuran dua senyawa dalam dua fasa dimana fasa gerak bergerak terhadap fasa diam. Fasa diam berupa suatu bidang datar.

Keuntungan dari metode Kromatografi Lapis Tipis adalah :

·  Pemisahan yang amat baik (noda yang dipisahkan lebih jelas dan terlokalisir)

·  Waktu yang diperlukan lebih singkat

·  Alat yang dipakai lebih sederhana dan relative murah

Kerugiannya :

·    Sukar dalam penyimpanannya

·    Ketelitian dan ketepatannya kurang baik

Teori Kromatografi Lapis Tipis umumnya sama dengan teori dari kromatografi kolom. Pada Kromatografi Lapis tipis derajad retensi dinyatakan sebagai faktor penghambatan (“Retardation factor” = Rf)

Jarak gerakan zat terlarut                    Jumlah mol zat terlarut dalam fasa gerak

        Rf = -------------------------  = ----------------------------------

Jarak gerakan pelarut                          Jumlah mol zat terlarut dalam kedua fasa

  

·  Jarak gerakan pelarut diukur sampai bidang batas pelarut

· Jarak gerakan zat terlarut diukur sampai tengah-tengah bercak atau titik kerapatan maksimum

Jarak lintasan yang ditempuh rata-rata molekul zat terlarut = kecepatan pelarut x waktu yang dihabiskan dalam fasa gerak. Faktor penghambatan (Rf) dapat dinyatakan sebagai perbandingan jumlah molekul dalam masing-masing fasa atau sebagai pembagian zat terlarut antara dua fasa.

Harga Rf merupakan bentuk modifikasi dari tetapan keseimbangan dan bergantung pada ukuran-ukuran retensi seperti halnya pada kromatografi kolom.

Nilai Rf dipengaruhi oleh beberapa variable seperti : penyerap, cara pengembangan, ukuran dan kadar cuplikan, jarak perjalanan bercak serta macam eluen yang dipakai. Oleh karena itu akan lebih baik jika digunakan nilai Rf relatif terhadap Rf baku yaitu perbandingan jarak perjalanan yang ditempuh bercak sampel dengan jarak perjalanan yang ditempuh zat baku dalam pengembangan yang sama.

2.  Teknis Eksperimental

a.    Garis Besar Metoda

Dibuat dahulu lapisan tipis dari bahan penyerap pada fasa pendukung yang inert (kaca). Serbuk bahan penyerap yang halus dibuat bubur dengan air atau pelarut organik yang mudah menguap. Bubur tersebut kemudian diratakan pada lempeng pendukung dengan suatu alat dan dengan ketebalan yang dapat diatur. Sesudah kering lempeng lapis tipis tersebut diaktifkan dengan cara dipanaskan pada suhu 100 ^oC selama paling sedikit 30 menit. Jika aktivasi telah dijalankan lempeng disimpan dalam eksikator, atau tempat lain yang bebas dari kelembaban. Setiap kali akan digunakan lempeng sebaiknya diaktifkan lagi.

Sampel dilarutkan dalam pelarut organik yang mudah menguap dan sesuai. Dengan pipet kapiler atau pipet micrometer, larutan sampel ditotolkan sedikit-sedikit dengan bercak sekecil mungkin. Dibiarkan kering sebentar, kemudian dimasukkan ke dalam bejana pengembangan yang telah dibuat jenuh dengan uap pelarut pengembang/“solvent”. Fasa gerak dibiarkan mengembang dan sedudah mencapai batas yang diinginkan lapisan tipis diambil dan dibiarkan kering, kemudian dilakukan penentuan lokasi dan identifikasi bercak dengan cara kimia, fisika atau biologi.

b.    Fasa Diam

Fasa diam yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis adalah bahan penyerap (“adsorbent”). Sifat umum dari bahan penyerap untuk Kromatografi Lapis Tipis sama dengan yang digunakan untuk Kromatografi Kolom. Dua sifat penting yang harus diperhatikan untuk Kromatografi Lapis Tipis adalah besar/kecilnya (ukuran) serta homogenitasnya, sebab daya lekat pada pendukung sangat ditentukan oleh kedua sifat tersebut. Partikel yang kasar tidak dapat memberikan pemisahan yang baik dan untuk memperbaikinya dapat digunakan butiran yang halus. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron. Berbeda dengan tujuan untuk kromatografi kolom, dimana partikel yang kecil dan halus dapat memperlambat aliran pelarut, sedang pada Kromatografi Lapis Tipis malahan akan mempercepat aliran pelarut.

Beberapa macam bahan penyerap yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis :

1)    Silika gel

Paling banyak dipakai dan bersifat asam, zat pengikatnya untuk memberikan kekutan pada lapisan dan menambah adisi pada gelas penyokong, biasanya dalah Kalsium sulfat (CaSO4 ) = Plaster of Paris = Gypsum.

Dalam perdagangan biasanya silica gel telah diberi zat pengikat misalnya Silica gel “G” Merck. Suspensi silica gel yang “G” telah dicampur dengan air harus dipakai paling lambat 3 – 4 menit sesudah dibuat. Disamping Kalsium sulfat (CaSO4) semihidrat dapat pula dipakai tepung beras sebagai pengikatnya, tetapi kurang baik. Jika zat yang dipisahkan basa-basa, maka pelarut sebaiknya mengandung sedikit Amonium hidroksida atau dietilamin ( ± 1 % ). Jika asam-asam yang akan dipisahkan perlu ditambah asam asetat ( ± 1 % ). Asam dan basa ini bersifat pertolongan aditif sebagai buffer untuk zat yang akan dipisahkan → akan tetap dalam bentuk non ionik, sehingga dapat memberikan noda yang kompak. Disamping air dapat pula dipakai pelarut organik misalnya aseton, atau kloroform dan metanol ( 2 : 1) untuk membuat pastanya. Untuk memudahkan identifikasi ditambah lagi dengan zat yang berfluoresensi sehingga dikenal “Silica gel GF”.

Beberapa tipe silica gel :

a)    Silika gel G : Silika gel dengan zat pengikat, yang biasa digunakan adalah CaSO4  dengan kadar antara 5 – 15 %.

b)   Silika gel S  : Silika gel yang menggunakan zat tepung (pati) sebagai zat pengikat. Tetapi penggunaan pati sebagai pengikat mempunyai kelemahan, terutama jika penentuan lokasi bercak dengan asam sulfat dan atau Iodium.

c)    Silika gel GF 254 : Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi. Jenis silica gel ini biasanya berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar ultra violet panjang gelombang pendek. Sebagai indikator biasanya digunakan Timah Kadmium Sulfida atau Mangan Timah Silika aktif.

d)   Silika gel H / N : Silika gel tanpa pengikat. LApisan ini dibandingkan dengan yang mengandung CaSO4, menunjukkan hasil yang lebih stabil.

e)    Silika gel HF254 : Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indikator fluoresensi.

f)     Silika gel PF 254 = 366 : Silika gel untuk keperluan preparatif yang mengandung campuran dua indikator untuk cahaya ultra violet panjang gelombang panjang dan pendek.

g)    Silika gel modifikasi  Silika gel yang ditambah dengan polisiloxane biasanya disebut silika gel Silanised dan digunakan untuk Kromatografi Lapis Tipis fasa terbalik.

2)    Alumina

Alumina atau aluminium oksida ( Al2O3 ) suatu adsorban yang sedikit bersifat basis. Tetapi kini dalam perdagangan ada juga yang bersifat asam dan netral

a)    Al2O3 bersifat basis ( pH = 9 )

b)    Al2O3 bersifat netral ( pH = 7,5 )

c)     Al2O3 bersifat asam ( pH = 4 )

Daya menyerapnya tidak sekuat silika gel. Tidak baik untuk memisahkan asam-asam karena akan diikat lebih kuat pada adsorben dan sangat susah bergerak. “Edge – effect” disebabkan penyerapan yang tidak rata dari pelarut. Komponen yang mudah menguap,pada sisi keping lapis lebih mudah daripada di tengah ® karena itu harga Rf makin ke pinggir (sisi) makin besar ® perlu penjenuhan, dipakai kertas saring pada sisi bejana. Terutama dipakai untuk memisahkan basa-basa.

3)    Selulosa

Penyerap jenis ini dapat digunakan dengan atau tanpa bahan pengikat. Pada Kromatografi Lapis Tipis, penyerap ini terdapat sebagai butiran-butiran yang halus dan ukurannya sama, berbeda seperti pada Kromatografi kertas dimana selulosa berupa serabut. Lapisan tipis yang dibuat dari sellulosa mempunyai ruang antara yang lebih kecil,akan tetapi lebih teratur sehingga aliran pelarut lebih cepat dan peristiwa difusi lebih sedikit.

4)    Sephadex

Jenis penyerap ini yang digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis mempunyai ukuran 10 – 40 mm dan digunakan untuk pemisahan zat atas dasar perbedaan besar molekul seperti protein, hormon, enzim, asam amino dan lain lain.

5)    Kiesulguhr ( Diatomaceus earth )

Adalah suatu adsorben yang netral, tetapi daya adsorpsinya lebih lemah daripada silika gel atau alumina dan mempunyai daya pemisahan lebih kecil. Dapat ditambahkan pada silika gel untuk mendapatkan bentuk yang kurang aktif, untuk memisahkan zat-zat yang sangat polar misalnya : karbohidrat, asam-asam amino.

6)    Magnesium silikat

1 bagian Magnesium silikat dengan 3 bagian air dikocok dan dioleskan.

Bahan penyerap yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis

Bahan penyerap	Digunakan untuk memisahkan
Silika gel	Asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, mimyak menguap, anion dan kation organik, steroid dan terpenoid
Alumina	Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin,karotenoid dan asam amino
Keisulguhr	Gula, oligosakarida, asam-asam lemak, trigliserida, asam-asam amino, steroid
Serbuk selulosa	Alkaloid,asam amino dan nukleotid
Pati ( Amylum )	Asam amino
Sephadex	Asam amino dan protein
Poliamida	Protein, asam-asam aromatik, antioksidan, antosianin dan flavonoid

c.     Fasa Gerak

Pemilihan fasa gerak untuk Kromatografi Lapis Tipis tergantung pada faktor yang sama pada pemilihan fasa gerak untuk keperluan Kromatografi Kolom penyerapan. Sebaiknya digunakan pelarut yang polaritasnya rendah sebab pelarut dengan polaritas yang tinggi sifat kromatografi berubah menjadi kromatografi pembagian, disamping itu pelarut tersebut dapat mempermudah lepasnya/rusaknya lapisan tipis. Selain pelarut tunggal dapat juga digunakan campuran pelarut tetapi sebaiknya jangan lebih dari 3 jenis pelarut sebab campuran yang lebih kompleks akan cepat mengalami perubahan-perubahan fasa terhadap perubahan suhu. Kemurnian pelarut penting karena dalam hal ini digunakan untuk pemisahan sampel dengan jumlah sedikit.

Skema hubungan antara fasa diam, gerak dan senyawa yang dipisahkan

Untuk memisahkan senyawa hidrokarbon dengan cara kromatografi penyerapan, maka hidokarbon yang jenuh akan sukar diadsorpsi hingga perjalanannya paling cepat. Hidrokarbon yang mempunyai ikatan rangkap akan lebih kuat diserap dan banyak ikatan rangkapnya makin kuat penyerapannya. Adanya gugus fungsional akan menaikkan afinitas adsorpsi, dimana akan bertambah menurut urutan berikut : CH3, OR ( Alkali ), C=O ( Karbonil ), NH2 ( Amina ), OH ( Hidroksil ) dan COOH ( Karboksil ). Maka untuk memisahkan hidrokarbon yang banyak mempunyai ikatan rangkap diperlukan yang aktif dan pelarut yang polar. Untuk penentuan fasa gerak dan diam pada pemisahan suatu senyawa maka dapat dilakukan pergerakan dari segitiga ke tengah. Misalnya unrtuk pemisahan senyawa non polar (lipida), pertama-tama ujung segitiga digerakkan ke kata non polar dari senyawa yang dipisahkan. Dua ujung segitiga lain akan menuju angka I pada aktivitas fasa diam dan kata non polar pada deret Eluotropik pada fasa gerak. Artinya untuk memisahkan senyawa yang non polar ( misal lipida atau hidrokarbon ) harus digunakan bahan penyerap yang aktif dan pelarut yang kurang polar.

d.    Pembuatan lapisan tipis

Pendukung yang biasa digunakan adalah kaca dengan ukuran 20 x20 cm atau 20 x 10 cm. Permukaan pendukung harus rata dan bebas noda lemak. Kadang-kadang untuk pemisahan secara cepat dan untuk keperluan kualitatif dapat digunakan obyek gelas yang digunakan pada mikroskop.

Bahan penyerap dibuat bubur dengan air dengan perbandingan 1 bagian penyerap dengan 2 bagian air. Bila dipakai bahan penyerap yang mengandung bahan pengikat, maka pembuatan bubur sampai lapisannya harus selesai dalam waktu 4 menit, sebab setelah itu akan terjadi pengerasan. Kadang-kadang dapat ditambahkan pula suatu zat yang berfluoresensi.

Pada kromatografi lapis tipis, tebal lapisan merupakan faktor penting pada pola pemisahan komponen, biasanya tebal lapisan 0,25 mm tetapi untuk keperluan preparatif tebal lapisan dapat lebih tebal ( 0,5 – 2,0 mm ).

Pada waktu pemanasan, lapisan yang amat tipis memberikan hasil pemisahan yang tidak tetap.

Pembuatan lapisan tipis dapat dilakukan dengan 4 cara :

1)    Pembentangan

Cara yang biasa dilakukan adalah wadah tempat bubur, bahan penyerap digerakkan pada kaca yang berkedudukan tetap. Ada juga cara pembentangan dimana kaca yang bergerak.

2)    Penuangan

Bahan penyerap yang sangat halus, homogen dan tidak mengandung bahan pengikat dituangkan pada pendukung dan dibiarkan mengalir sampai rata. Cara penuangan ini biasanya dilaksanakan untuk alumina sebagai bahan penyerap dan sebagai cairan adalah pelarut yang mudah menguap

3)    Penyemprotan

Dengan cara ini sukar didapat lapisan yang rata dan ketebalannya sukar diketahui.

4)    Pencelupan

Cara ini terutama untuk pembuatan lapisan dengan ukuran kecil seperti sebesar gelas mikroskop. Dapat dilakukan dengan mencelupkan pendukung ke dalam bubur bahan penyerap dalam pelarut yang mudah menguap. Tebal lapisan yang pasti tidak diketahui dan kadang-kadang kurang rata. Untuk kualitatif cara ini cukup memadai.

Lapisan tipis yang sudah jadi dan kering kemudian diaktifkan dengan jalan dipanaskan pada 100 oC selama 30 menit dan kemudian disimpan dalam eksikator. Pada saat ini telah banyak diperdagangkan lapisan tipis yang kebanyakan lebih baik, kompak, rata dan memberikan pemisahan yang sempurna.

e.    Pengembangan

Bila cuplikan telah ditempatkan maka kemudian lapisan dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan uap pelarut yang digunakan. Tepi bagian bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak (pelarut) kira-kira 0,5 – 1 cm.Bejana kromatografi harus ditutup rapat, kalau dapat volumenya sekecil mungkin serta tidak berhubungan dengan atmosfir di luar bejana. Untuk penjenuhan bejana biasanya pada dindingnya dilapisi kertas saring yang tercelup dalam fasa gerak.

Ada tiga cara pengembangan dalam Kromatografi Lapis Tipis :

1)    Menaik

Cara yang umum digunakan

2)    Menurun

Dimaksudkan untuk memperpanjang jarak gerakan. Komponen yang mempunyai nilai Rf kecil dapat terpisah dengan baik. Lapisannya tebal, fasa geraknya kental.

3)    Mendatar

Pengembangan mendatar dapat berupa pengembangan satu arah ataupun radial.

Pengembangan satu arah dimaksudkan untuk pemisahan dengan suhu yang lebih rendah  dari suhu kamar, dapat dikerjakan dengan menggunakan alat pendingin. Pengembangan radial digunakan dengan memenfaatkan efek konsentrasi dan penyebaran zona-zona dalam garis-garis tipis dan bukan sebagai bercak-bercak. Dengan cara ini dapat dipisahkan komponen-komponen yang mempunyai harga Rf berdekatan. Pengembangan radial, fasa geraknya dialirkan dengan sumbu atau pompa melalui pipa kapiler di tengah lapisan, senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah totolan ® lingkaran.

f.     Deteksi Bercak Pemisahan

Bercak pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna dan untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika maupun biologi.

1)    Cara kimia

Yang biasa digunakan adalah direaksikan dengan suatu pereaksi sehingga noda jadi tampak terlihat. Pada Kromatografi Lapis Tipis tidak dilakukan dengan cara pencelupan tetapi penyemprotan. Untuk senyawa organik dapat dilakukan dengan disemprot dengan asam sulfat pekat dan kemudian dipanaskan pada 200 oC selama 10 menit. Bercak dari senyawa organik akan berwarna hitam. Pereaksi lain untuk senyawa organik adalah Iod. Lapisan yang berisi hasil pemisahan diletakkan dalam bejana tertutup yang telah diisi dengan kristal Iod. Dibiarkan beberapa saat untuk memberi kesempatan terjadinya uap Iod. Warna bejana ungu, sedang bercak berwarna coklat, senyawa organik tidak jenuh akan tidak berwarna. Jika dikeluarkan, warna bercak akan cepat hilang, sehingga perlu cepat-cepat menandai bercak. Keuntungan Iod sebagai penampak bercak adalah tidak merusak senyawa. Untuk senyawa-senyawa lain, kadang-kadang dapat digunakan pereaksi yang spesifik untuk senyawa tersebut.

2)    Cara fisika

Yang dapat digunakan untukmenampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultra lembayung. Fluoresensi sinar ultra lembayung terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapannya yang diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya yang kelihatan berfluoresensi.

3)    Cara biologi

4)    Dapat digunakan untuk senyawa yang misalnya mempunyai aktivitas biologis, seperti anti bakteri atau dapat menghidrolisis.Lapisan hasil pemisahan dialiri dengan suspensi bakteri misalnya, maka pada bercak itu akan terlihat tidak adanya pertumbuhan bakteri.

g.    Identifikasi Harga Rf

Faktor yang mempengaruhi harga Rf

1)    Bahan penyerap, sifat dan aktivitasnya

Penyerap yang berbeda memberikan hasil pemisahan yang berbeda walaupun fasa gerak dan bahan yang dipisahkan sama. Harga Rf dipengaruhi oleh aktivitas dari bahan penyerap karena dapat mempengaruhi daya adsorpsi. Aktivitas dapat dicapai dengan pemanasan yang berarti pengusiran terhadap molekul-molekul air.

2)    Tebal dan kerataan dari lapisan

Ketidakrataan lapisan menyebabkan aliran fasa gerak tidak sama sehingga harga Rf juga tidak sama. Tebal baku yang biasa digunakan adalah 0,25 mm

3)    Kemurnian fasa gerak

Pelarut yang tidak murni akan memberikan pemisahan yang kurang baik. Demikian juga jika digunakan fasa gerak yang berupa campuran, maka perbandingan yang dipakai harus diperhatikan dan ditepati.

4)    Kejenuhan bejana kromatografi

Pemisahan yang dilakukan dalam dua bejana yang mempunyai kejenuhan tidak sama juga memberikan harga Rf yang tidak sama.

5)    Suhu

Pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu yang tetap, dimaksudkan untuk mencegah perubahan komposisi fasa gerak atau kejenuhan dari bejana.

6)    Jumlah cuplikan yang dianalisis

Jumlah cuplikan yang dianalisis jika terlalu banyak maka ada dianalisis jika terlalu banyak maka ada kecenderungan terjadi penyebaran-penyebaran bercak atau terjadinya ekor sehingga akan memperbesar kesalahan harga Rf. å cuplikan 10–20 mg

7)    Kesetimbangan

Faktor kesetimbangan ini terlihat lebih nyata pada Kromatografi Lapis Tipis dibanding pada Kromatografi kertas,sehingga sangat perlu untuk kromatografi Lapis Tipis diusahakan ruangan di dalan bejana jenuh dengan uap pelarut. Ketidakseimbangan di dalam bejana akan terlihat dari permukaan fasa gerak yang berbentuk cekung atau fasa gerak lebih cepat pada bagian tepi dibanding bagian tengah.

8)    Struktur dan sifat kimia senyawa yang dipisahkan

Sifat kimia seperti mudah larut, tekanan uap dan kepolaran dapat mempengaruhi harga Rf dari suatu senyawa dibanding senyawa yang lain.

9)    Mutu pelarut

Harus dipakai pereaksi yang pro analisa jika diperlukan pelarut campur, maka harus diperbaharui pada waktu-waktu tertentu,karena menguapnya pelarut yang mudah menguap akan mengubah susunan pelarut.

10)     Teknik

Sudut yang dibentuk waktu meletakkan plat/keping dalam bejana tidak begitu mempengaruhi harga Rf, tetapi bila dipakai metoda menurun atau mendatar/horisontal (tidak menaik) akan mempengaruhi

4.   Variasi Kromatografi Lapis Tipis

Dengan tujuan untuk mencapai pemisahan yang sempurna dan memperluas pemakiannya maka Kromatografi Lapis Tipis mengalami berbagai perubahan seperti :

a.    Kromatografi lepas tipis

Pada pendukung dari kaca, serbuk kering bahan penyerap dibentangkan dan diratakan. Cuplikan ditempatkan dan dilakukan pengembangan mendatar. Untuk penentuan lokasi dapat dilakukan penyemprotan

b.    Lapisan bertingkat ( “gradient plate” )

Cara ini mempunyai daya adsorpsi yang berbeda sepanjang lapisan. Dapat dibuat dengan alat khusus yang disebut “gradient spreader” dimana diisi dengan dua macam bubur bahan penyerap misalnya A dan B. Lapisan berubah dari 100 % A ke 100 % B. Cara ini dapat digunakan untuk menemukan campuran bahan penyerap yang terbaik.

c.     Pengembangan Bertingkat ( “gradient elution” )

Komposisi fasa gerak selalu berubah selama pengembangan. Lapisan dapat dimasukkan ke dalam fasa gerak misalnya suatu pelarut dan kemudian fasa gerak yang kedua ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk-aduk.

d.    Pengembangan berganda ( “multiple elution” )

Pengembangan dilakukan pada arah yang sama dan dilakukan berkali-kali baik dengan pelarut yang sama atau yang divariasi.

e.    Lapisan beralur ( “grooved plates” )

Pendukung yang berasal dari kaca gelas yang diberi garis-garis, maka setelah bahan penyerap dibentangkan akan terjadi lapisan yang beralur. Pada tiap jalur ditempatkan bercak cuplikan.

f.     Lapisan dengan pendukung yang lentur

Lapisan ini sudah banyak diperdagangkan misalnya pendukung lembaran poliester dimana bahan penyerap dengan pengikat polivinil asetat dibentangkan di atasnya. Contoh pendukung lain adalah kertas selulosa yang dilapisi dengan bahan penyerap.

g.    Kromatografi fasa balik ( Reversed phase partition chromatography )

Lapisan tipis yang sudah jadi dicelupkan dalam pelarut yang non polar tetapi mudah menguap atau pelarut tersebut dibiarkan mengalir melewati lapisan tadi. Dengan cara itu maka fasa diam bersifat non polar. Sebagai fasa gerak digunakan pelarut polar seperti air, metanol atau asetonitril. Hasil pemisahan berbeda dengan kromatografi normal  dimana pada cara ini komponen yang paling polar terelusi lebih dahulu.

Perkembangan dari kromatograf lapis tipis (TLC) adalah kromatografi lapis tipis penampilan tinggi (HPTLC), perbandingan  TLC dan HPTLC sebagai berikut

Parameter	TLC	HPTLC
Ukuran partikel	12 – 50 mm	5 – 6 mm
Tebal layer	0,1 – 0,3 mm	0,1  atau 0,2 mm
Jarak pengembangan	10 ~ 15 ~ 20 cm	3 – 6 cm
Jarak pemisahan	100 – 120 mm	50 mm
Volume penotolan	0.5 – 5 mL	0,1 – 1 mL
Ukuran sampel	3 – 4 mm	1 – 1,5 mm

Keuntungan HPTLC :

·  Memperkecil difusi sehingga meningkatkan efisiensi pemisahan

·  LOD menurun 1/10 hingga 1/15 x lebih kecil

·  Lebih ekonomis (plate / solven per sampel lebih kecil)

3.    KROMATOGRAFI KOLOM

               

        Kromatografi kolom berguna untuk sampel yang mengandung molekul besar atau zat yang bersifat ion dengan tekanan uap yang rendah dan untuk zat yang termolabil yang tidak dapat diuapkan tanpa penguraian.

a.    KROMATOGRAFI ADSORPSI

                Sifat-sifat atom, ion atau molekul yang terletak pada permukaan partikel padat ternyata berbeda dengan sifat-sifat atom, ion atau molekul yang terletak pada bagian sebelah dalam dari partikel padat. Ikatan-ikatan yang terletak pada bagian permukaan dipengaruhi oleh tidak terdapatnya struktur kimia di atomnya, karena itu lapisan permukaan berada pada tingkat energi yang lebih tinggi dan hal ini dikatakan mempunyai aktivitas permukaan.

                Bila partikel padat dicelupkan dalam suatu cairan, maka permukaan zat aktif tersebut menarik dan cenderung mengadsorpsi species (atom, ion atau molekul) dari cairan tadi. Gaya tarik tersebut mungkin bersifat ionik (elektrostatik). Bila cairan tersebut berupa suatu larutan, maka salah satu atau semua zat terlarut atau pelarutnya mungkin dapat diadsorpsi. Adsorben yang baik harus mempunyai daerah permukaan yang luas yang mengandung banyak bidang-bidang yang aktif secara kimiawi. Biasanya permukaan tersebut akan kehilangan aktivitasnya jika tertutup oleh suatu lapisan species yang diadsorpsi.

                Bila suatu larutan mengalir melalui permukaan aktif dari zat padat, maka suatu keseimbangan akan terbentuk untuk proses adsorpsi atau desorpsi dari species yang terdapat dalam larutan tersebut.

Hubungan antara kadar species dalam larutan dan jumlah yang disdsorpsi dapat dinyatakan sebagai suatu persamaan atau grafik hubungan Cs (yang diadsorpsi) dan CM (yang ada dalam fasa gerak) dan garis yang diperoleh disebut adsorption isotherm.

Diperoleh bermacam-macam bentuk garis seperti :

Garis lurus            

Bentuk seperti ini menunjukkan bahwa permukaan adsorben tidak menjadi jenuh dengan species yang ada. Keadaan ini adalah yang diinginkan. Kemiringan dari garis memberikan koefisien distribusi yang dalam hal ini tidak tergantung pada ka.

Kadar jumlah :

  

K = Cs / CM            atau       Cs = K CM           

Garis cembung    

Bentuk ini disebabkan adanya variasi dari bidang adsorpsi yang ada. Banyak sistem cair padat yang mengikuti hubungan ini yang dikenal sebagai Freundlich isotherm    

K = Cs / CM            atau       Cs = K CM           

Garis cekung        

Terjadi bentuk ini dikarenakan adanya reaksi-reaksi tambahan pada peristiwa adsorpsi yang kadang-kadang dapat meningkatkan proses adsorpsi secara keseluruhan.

Mengingat bahwa laju perjalanan dari suatu komponen melalui sistem kromatografi merupakan fungsi dari bagian komponen yang terdapat pada dalam fasa gerak dan bila pita yang dihasilkan memencar maka tentunya ada daerah yang berkadar tinggi dan terletak dibagian tengah. Bila bentuk kurva itu cembung maka pusat pita akan berjalan pada laju yang lebih cepat dibanding dengan kedua ujung haluan dan butitan.

Pada kasus yang luar biasa pusat tersebut hampir menyusul ujung haluan, sehingga memberikan batas depan yang tajam dan ujung buritan yang panjang. Hal ini disebut band tailing dan jelas kejadian ini tidak diharapkan. Kejadian yang berlawanan terjadi jika bentuk kurva seperti garis cekung dimana memberikan ujung haluan panjang dan batas belakang yang tajam ( fronting ) . Band tailing lebih jelas dengan adsorben yang aktif. Salah satu cara mengurangi akibat buruk adalah membuat tidak aktif sebagain zat padat dengan menutup bidang yang aktif dengan zat lain atau dengan menaikkan suhu. Pendekatan lain adalah mengurangi ukuran dari sampel sehingga sistem tersebut masih berada dalam bagian yang hampir lurus dari isotherm yang diperoleh pada kadar yang sangat rendah.

Adsorben ( Penyerap )

Banyak zat padat yang dapat dipakai sebagai adsorben . Kemungkinan yang paling popular dan biasanya digunakan sebagai penyerap adalah alumina, tetapi tidak berarti yang lain tak dapat digunakan.

Suatu pengertian yang digunakan dalam hubungannya dengan adsorben adalah “aktivasi”. Kadang-kadang ini dihubungkan dengan luas permukaan spesifik dari zat padat, yaitu luas permukaan yang diukur dalam meter persegi dalam tiap gram, dalam hal karbon, silica gel dan alumina dapat dibuat menjadi aktif dengan memiliki permukaan spesifik beratus-ratus meter persegi. Sedangkan seperti kalsium karbonat dan kalsium hidroksida, mempunyai luas permukaan spesifik yang mempunyai ukuran dalam puluhan meter persegi atau kurang, hingga ini dapat dikatagorikan relative kuarang aktif. Dalam kromatografi pengertian “aktivitas”  sering digunakan untuk menyatakan kekuatan dari adsorpsi. Kekuatan adsorpsi dari gugus polar pada senyawa-senyawa polar naik dengan urutan :

-  CH = CH, -OCH, -CO2R, =C=O, -CHO, =SH, -NH2, -OH, -CO2H

Banyak penyerap seperti alumina, silika gel, karbon aktif dan magnesium silikat dapat diperoleh dalam perdagangan. Sebelum dipakai mereka sering memerlukan aktivasi yang dapat dikerjakan dengan pemanasan, mungkin dengan pengurangan tekanan. Untuk aktivasi alumina biasanya dengan pemanasan 400 oC selama 4 jam. Tanpa keterangan lain dilakukan pemansan 200 oC selama 2 jam.

Pemilihan suatu pelarut untuk elusi adalah sama pentingnya dengan pemilihan adsorben. Fasa gerak cair tidak hanya menyediakan pengangkutan sebagai wahana tetapi juga mempengaruhi koefisien pembagian melalui daya pelarutnya. Disamping kelarutan relatif zat terlarut dalam pelarut elusi, perlu dipertimbangkan pula persaingan antara zat terlarut dengan pelarut terhadap bidang adsorpsi pada permukaan dari fasa diam.

Pelarut yang mengelusi zat terlarut cepat tidak akan dapat memisahkan dengan baik, sebaliknya pelarut yang bergerak terlalu lambat akan memberikan waktu retensi yang terlalu panjang. Waktu retensi yang terlalu panjang dapat menyebabkan pelebaran pita dan peristiwa pengenceran yang tidak perlu. Kadang-kadang perlu digunakan suatu campuaran pelarut atau suatu seri pencampuran ( gradient elution ) dengan variasi eluen yang polaritasnya makin tinggi.

Zat padat	Digunakan untuk memisahkan
Alumina/magnesia	Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester, alkaloid-alkaloid, senyawa anorganik
Silika gel	Sterol-sterol, asam-asam amino
Karbon	Peptida-peptida,karbohidrat-karbohidrat, asam-asam amino
Magnesium silikat	Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-alkaloida
Magnesium karbonat	Porphirin
Kalsium hidroksida	Karotenoida-karotenoida
Kalsium karbonat	Karotenoida-karotenoida, Xantofil
Kalsium fosfat	Enzim-enzim, protein-protein, polinukleotida-polinukleotida
Aluminium silikat	Sterol-sterol
Pati	Enzim-enzim
Gula	Klorofil, xantofil

Ada istilah yaitu kekuatan adsorpsi dari suatu adsorben dalam kolom. Untuk adsorben yang polar (seperti alumina dan silica gel ) kekuatan adsorpsinya naik jika polaritas zat yang diadsorpsi juga naik. Menurut Trappe kekuatan elusi dari pelarut-pelarut berikut akan diturunkan dalam suatu kolom yang berisi silika gel :

Air < metanol < etanol < propanol < aseton < etilasetat <dietil eter < kloroform < metilena klorida < benzene < toluene ( trikloroetilena ) < karbontetraklorida < sikloheksana < heksana

Sedang untuk adsorben karbon aktif, pelarut-pelarut di bawah ini diturunkan daya elusinya untuk pemisahan asam-asam amino dan sakarida-sakarida

Etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < metanol < air

Dari kedua contoh tersebut dapat diambil kesimpulan bahwa daya elusi pelarut sangat tergantung pada fasa padat (adsorben) dan zat yang dipisahkan (zat terlarut).

Pada dasarnya suatu hidrokarbon yang tidak polar akan diikat lebih erat pada isi kolom yang tidak polar dibandingkan dengan zat yang polar.

Teknik analisis

1)    Pengisian kolom

Pengisian adsorben yang tidak baik akan menyebabkan rusaknya batas-batas jalur-jalur  kromatografi. Adanya gelembung udara atau tempat berongga pada kolom mengakibatkan putusnya penyerap (adsorben). Kolom yang digunakan untuk kromatografi biasanya mempunyai garis tengah yang besar sehingga dapat dilakukan penggoyangan atau penekanan selama pengisian adsorben, cara tersebut disebut cara kering.

Cara lain untuk pengisian adsorben adalah dengan menuangkan pelan-pelan bubur adsorben dalam pelarut. Biasanya perlu disertai dengan penggoyangan pelan-pelan untuk mendapatkan pengisian yang homogen dan jika adsorben yang digunakan mempunyai ukuran yang sama maka akan lebih mudah dicapai pengisian yang homogen, Yang perlu mendapatkan perhatian adalah jangan sampai ada penyerap yang kering.

Untuk menunjang bahan penyerap maka pada bagian bawah kolom diberi sumbat dari kapas, gelas wool atau penyaring dari gelas.

2)    Pemasukan cuplikan

Cuplikan dimasukkan dan dibuat serata mungkin pada puncak dari kolom. Cuplikan dalam bentuk larutan yang pekat dan jangan sampai terjadi jalur-jalur yang terputus. Untuk memperoleh permukaan yang rata biasanya pada bagian atas kolom diberi kertas saring atau dengan pasir yang bersih. Untuk memasukkan sampel dapat digunakan pipet yang kecil dan panjang. Ujung pipet digerakkan ke sekeliling kolom dan hendaknya ujung pipet jangan menyentuh adsorben. Cuplikan yang tertinggal pada dinding kolom dapat dilarutkan dengan pelarutnya. Setelah semua cuplikan berada dibagian atas kolom maka dapat ditambahkan eluen perlahan-lahan menggunakan corong pisah dan diberikan beberapa waktu ( 5 menit ). Setelah itu proses elusi dapat dimulai.

3)    Elusi

Ada tiga macam cara elusi yaitu :

                   Elusi sederhana

Yaitu elusi yang menggunakan campuran pelarut dengan komposisi yang tidak berubah selama proses pemisahan.

Elusi berfraksi ( fractional elution)

Adalah elusi dimana untuk memisahkan suatu komponen dari suatu campuran digunakan satu macam eluaen, sehingga untuk memisahkan suatu campuran perlu digunakan bebarapa macam eluen yang berbeda-beda.

Elusi bertingkat ( gradient elution )

Adalah elusi untuk memisahkan suatu komponen campuran dimana eluen yang digunakan terus menerus berubah. Misalnya mula-mula digunakan air dalam pemisahan dan kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit pelarut yang lain misalnya etanol.

4)    Cara deteksi

Kebanyakan fasa diam berupa suatu serbuk yang berwarna putih atau tidak berwarna sehingga memberi kemudahan untuk mengamati pemisahan zat yang berwarna. Dalam teknik yang khusus lusi dihentikan jika pita yang pertama tampak pada ujung bawah. Kemudian bahan penyerap dikeluarkan dan ditambahkan suatu peraksi yang dapat menunjukkan posisi pita. Komponen-komponen yang terpisah dapat diekstraksi dengan pelarut yang sesuai.

Cara lain adalah memisahkan setiap fraksi dari eluen dan dipeiksa dengan alat-alat lain seperti spektrofotometer, fluorometer, pH meter dan sebagainya. Selain itu fraksi pelarut dapat diuapkan dan diidentifikasi.

b.    KROMATOGRAFI KOLOM PEMBAGIAN

                Di dalam sistem kromatografi pembagian, fasa diam berupa zat cair sedang fasa gerak dapat berupa zat cair ataupun gas. Kalau pada kromatografi penyerapan digunakan zat padat maka pada kromatografi pembagian zat padat digunakan sebagai penunjang fasa diam ( yang berupa zat cair ). Zat penunjang harus mengadsorpsi dan menahan fasa diam dan membuat luas permukaan fasa diam seluas-luasnya.  Selain itu juga dipersyaratkan harus stabil, mudah diisikan dan tidak menghalangi aliran fasa gerak. Senyawa yang dipisahkan dengan sendirinya akan terdistribusi diantara dua zat cair tergantung dari koefisien pembagiannya. Sebagai zat padat penunjang dapat digunakan silika gel, serbuk selulosa dan tanah diatomae.

1)    Teknik Analisis

a)    Pemasukkan penyerap

Mula-mula mencampur penunjang dengan cairan yang akan digunakan sebagai fasa diam, diaduk-aduk dan dibuat bubur dengan fasa gerak yang akan digunakan. Bubur ini kemudian dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit dimana kolom telah diisi dengan sedikit pelarut.Sebaiknya setiap pemasukkan bubur ke dalam kolom disertai dengan penekanan dengan batang gels yang ujungnya datar. Semakin kompak isi kolom semakin baik pemisahan yang terjadi.

b)   Pemasukkan cuplikan

Cara pemasukkan cuplikan dengan menggunakan pipet seperti pada kromatografi kolom adsorpsi. Cara lain adalah dengan melarutkan cuplikan dalam suatu pelarut dan mencampurkannya dengan sejumlah zat padat penunjang sehingga diperoleh suatu bubuk yang kering. Bubuk ini kemudian diletakkan dibagian atas kolom dan sedikit fasa gerak ditambahkan.

c)    Elusi

Cara elusi yang digunakan dalam kromatografi kolom pembagian sama seperti ada kromatografi penyerapan. Jika fasa diam adalah molekul air maka fasa gerak dapat digunakan pelarut organik.

Pada perkembangan selanjutnya ada suatu teknik dalam kromatografi partisi dengan menggunakan pelarut organik yang bersifat non polar sebagai fasa diam, teknik ini dimaksudkan agar diperoleh nilai koefisien partisi yang lebih menguntungkan untuk proses pemisahan. Oleh sebab itu sebagai penunjang digunakan yang bersifat tidak polar. Teknik ini dikenal dengan Kromatografi partisi fasa terbalik.

Contoh beberapa pemisahan pada kolom partisi

Pemisahan	Penyokong	Fasa tetap	Fasa gerak
Alkohol-alkohol C1 – C4	Celite	Air	CHCl3 atau CCl4
Asam-asam lemak C1 – C4	Silika gel	Air	CHCl3 / n-BuOH
Asam-asam amina	Pati	Air	n-PrOH atau n-BuOH / HCl
Fenol-fenol	Selulosa	Air	Me-OH / n-BuOH / CHCl3
Lipida-lipida	Silika gel	Air	Bermacam-macam

b.      KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

                Asas pertukaran ion digunakan pada kromatografi kolom, kertas dan lapis tipis. Sebagai bahan penukar ion digunakan resin penukar ion sintetik yang mempunyai stabilitas kimiawi serta ukuran partikel yang seragam. Resin merupakan suatu polystyrene yang dibuat dengan proses polimerisasi dari styrene dan adanya sedikit divinyl benzene. Kemudian ke dalam polystyrene dimasukkan gugus-gugus polar yang dapat memberikan sifat pertukaran ion. Resin dapat dibuat dalam bentuk butiran-butiran atau dalam bentuk lembaran (membran). Selain polystyrene dapat juga digunakan asam polimetakrilat (polymetacrylic acid).

                Mekanisme pemisahan :

Resin penukar ion dibedakan menjadi 2 macam :

-  penukar kation yaitu yang   mempunyai  gugus  polar yang bersifat asam seperti :  -SO3H atau –COOH

-  penukar anion yaitu yang  mempunyai  gugus  polar  yang  bersifat  basa  seperti ; -CHNR

Untuk melukiskan pemisahan berdasar pertukaran ion, dapat dibayangkan suatu resin yang bersifat asam kuat (misal yang mengandung SO3H) dirumuskan sebagai RH. Jika butiran resin dimasukkan ke dalam air maka gugus sulfon akan terionisir seluruhnya, tetapi proton-protonnya tidak dapat pergi meninggalkan kerangka resin karena secara elektris tidak netral dan disebabkan tidak adanya kemungkinan dapat terjadi pertukaran antara kation tersebut dengan proton karena biasanya larutan juga terdapat anion.

                M+ + RH Û H+ + RM

                M+  adalah kation bebas

                RH adalah simbol dari proton yang terikat

Dengan mengingat adanya faktor aktivitas, maka dapat ditulis persamaan sebagai berikut

aH+  aRM

Kd = ───────

aM+ aRH

Kd sering dikenal sebagai koefisien distribusi keseimbangan atau koefisien selektivitas. Untuk larutan yang encer selektivitas dapat diganti dengan kadar.

Bila larutan yang mengandung ion M mengalir lewat kolom resin maka akan diganti oleh ion H sesuai dengan harga dari Kd. Bila larutan yang dituangkan hanya sedikit dan kemudian dilakukan pencucian dengan air murni maka semua ion M akan diganti seluruhnya oleh ion H dan membentuk pita adsorpsi yang diam (stasioner). Distribusi ion-ion dalam pita akan tergantung pada harga Kd, bila harga Kd besar maka pita akan sempit dan pekat, sebaliknya jika Kd kecil maka pita adsorpsi akan lebar dan defus. Supaya pita adsorpsi ion M bergerak ke bawah maka perlu dielusi dengan larutan asam atau larutan kation lain sehingga dapat terjadi pertukaran ion. Ion M akan tercuci keluar dari kolom dan akan meninggalkan dalam bentuk aslinya. Laju gerak ion-ion tidak tergantung pada pH dari asam pengelusi dan juga harga Kd. Jadi dua ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin akan bergerak keluar dengan laju yang tidak sama dan terjadilah proses pemisahan.

Teknik Analisis

1)    Pembuatan Resin

Dalam perdagangan banyak didapatkan bermacam-macam resin, sehingga orang harus memilih dengan berbagai kriteria seperti ukuran partikel, persentase hubungan silang dan kualitas sesuai dengan tujuan analisis. Kualitas Analytical Grade biasanya disukai karena mempunyai ukuran yang seragam serta bebas dari bahan organik atau anorganaik pengganggu.

Beberapa sifat dari resin untuk keperluan analisis :

a)    harus mempunyai gugus pertukaran yang berfungsi tunggal

b)   mempunyai derajat hubungan silang yang tertentu ( 4 – 8 % )

c)    ukuran partikel sebaiknya sekecil mungkin

Kadangkala perlu dilakukan perubahan bentuk resin yaitu bentuk yang satu ke bentuk yang lain, misal dari bentuk hidrogen menjadi bentuk natrium dengan cara pencucian memakai larutan natrium klorida pekat sampai eluennya bereaksi netral. Resin yang pernah dipakaipun perlu dilakukan peremajaan (regenerasi) untuk menaikkan kembali aktivitasnya.

2)    Pengisian Kolom

Untuk analisis mikro dapat digunakan buret dengan sumbat kapas atau gelas wool penyangga resin. Kolom biasanya dibuat dari gelas dengan suatu reservoir untuk tempat eluen yang diletakkan di sebelah atas. Pada bagian bawah diberi sumbat kapas atau gelaswool atau piringan berpori.

Resin diisikan dalam bentuk bubur dan dibiarkan mengenap dan kadang-kadang perlu digoyang-goyang. Setelah diisi puncak resin harus terendam cairan agar tidak kemasukkan udara. Di puncak resin sering ditempatkan kertas saring untuk mengecilkan gangguan yang dapat terjadi jika sampel ditempatkan.

3)    Metode Pemisahan

Karena pada kromatografi biasanya digunakan larutan sampel yang encer, maka pemisahan dengan teknik elusi banyak digunakan dan seringkali memberikan hasil yang memuaskan.

4)    Kapasitas Pertukaran Ion

Kapasitas pertukaran ion suatu kolom mempengaruhi ukuran sampel maksimum yang dapat dipisahkan dan digunakan untuk memeriksa stabilitas resin dalam jangka lama. Kapasitas resin dinyatakan dalam mili-ekivalen/gram resin kering, biasanya dituliskan pada dasar bejana oleh pabrik pembuatnya. Tetapi kapasitas ini mudah ditentukan dengan cara mengubah resin seluruhnya ke dalam bentuk hidrogen (bila tadinya bersifat kationik), dan kemudian dielusi dengan Natrium klorida hingga seluruhnya menjadi bentuk Natrium. Eluat tentu mengandung asam klorida dengan jumlah yang ekivalen dengan kapasitas kolom yang mudah ditentukan dengan titrasi Natrium hidroksida. Resin umumnya mempunyai kapasitas 1 – 5 miliekivalen / ml atau secara kasar 1 – 5 N dalam asam atau basa.

5)    Metoda Deteksi

Kesulitan menentukan komponen sampel dalam jumlah kecil dengan adanya ion eluen yang kadarnya tinggi, merupakan kerugian utama metoda pertukaran ion. Cara deteksi yang paling umum adalah mengumpulkan sesama volume fraksi-fraksi untuk spesies yang dicari. Digunakan pula cara deteksi dengan adsorpsi cahaya indeks bias, pH radioaktivitas, polarografi dan spektrofotometri.

3.   Pemakaian

a.    Untuk menghilangkan ion

Misalnya untuk menghilangkan ion-ion dari air sadah guna keperluan rumah tangga. Cara menghilangkan ion-ion ini dilakukan dengan mengalirkan air sadah tersebut mula-mula melalui penukar kation yang akan mengganti semua kation dalam air dengan hidrogen, selanjutnya dialirkan melalui penukar anoin dimana semua anion yang ada akan diganti dengan ion OH. Akibatnya garam yang ada akan diganti dengan senyawa air (ion-ion dari air). Dua macam resin penukar ion di atas dapat pula digabungkan menjadi satu lapisan tunggal hingga air cukup dialirkan satu kali saja. Air yang dihilangkan ionnya secara ini belum murni karena senyawa non elektrolit tidak dihilangkan pada proses ini.

Proses di atas digunakan pula untuk mengganti satu atau lebih ion pengganggu dengan ion yang tidak merugikan dan untuk menentukan kandungan garam jumlah dalam satu larutan (kation diubah menjadi hidrogen ion atau anion menjadi hidroksida ion, kemudian diikuti titrasi asam secara sederhana).

b.    Untuk menentukan kadar konstituen yang sangat kecil

Bila suatu ion terdapat sangat sedikit dalam volume yang sangat besar dan akan ditentukan kadarnya, salah satu metode yang terpilih adalah memisahkan ion tersebut dari dalam larutan dengan penukar ion kemudian diikuti dengan elusi ke dalam volume eluen yang lebih sedikit.

Cara ini merupakan langkah umum untuk menentukan jejak logam dalam air, untuk mendeteksi tembaga dalam air susu atau untuk memperoleh logam yang langka.

c.     Larutan baku primer dari asam kuat dan basa kuat

Sukar dibuat karena tidak adanya reagen baku primer, tetapi larutan baku primer natrium atau kalium klorida mudah dibuat dan larutannnya sangat stabil. Maka sejumlah tertentu dari larutan natrium klorida baku ini dialirkan lewat resin bentuk nitrogen atau hidroksida sehingga akan diperoleh asam atau basa dalam jumlah ekivalen. Dengan cara demikian dapat dibuat larutan baku asam kuat (klorida) atau basa kuat (natrium hidroksida).

d.    Pemisahan logam-logam

Pertukaran ion sangat menguntungkan untuk pemisahan logam-logam alkali dengan sifat yang sangat mirip, misalnya campuran logam alkali dan alkali tanah.

e.    Pemisahan asam-asam amino

Pada pH tertentu asam-asam amino dapat dipisahkan dengan mengalirkan mereka lewat dua macam resin. Sifat amfoternya memungkinkan bergantinya tanda muatan atau terhapusnya muatan hingga dapat dipisahkan ke dalam tiga golongan. Asam amino dapat dipisahkan dengan resin yang mengandung ion-ion logam yang tidak dimobilisir, seperti misalnya Cu dan Cd yang berperan sebagai tempat pertukaran ligand. Bila satu campuran asam amino dialirkan lewat resin semacam itu maka gugus asam amino akan bersaing untuk pembentukan kompleks dengan ion logam tersebut. Disini komponen sampel yang akan dipisahkan tidak perlu bersifat ionik dan prosesnya disebut ligand exchange.

c.     KROMATOGRAFI GEL

Pada kromatografi gel, fasa diam adalah gel yaitu suatu matriks polimer yang berpori-pori dan pori-porinya seluruhnya terisi oleh pelarut yang digunakan sebagai fasa gerak. Ukuran pori adalah sangat menentukan karena dasar pemisahan pada sistem ini adalah bahwa molekul yang ukuran besar diatas ukuran pori akan sama sekali tidak dapat masuk ke dalam gel, sedang molekul yang lebih kecil dari ukuran pori akan dapat masuk dan menggunakan sebagian atau seluruh ruangan bagian gel tersebut. Aliran fasa gerak akan menyebabkan molekul yang lebih besar bergerak melewati kolom tanpa hambatan tanpa menembus masuk ke dalam matriks gel, sementara molekul yang lebih kecil akan terhambat sesuai dengan masuknya ke dalam gel. Komponen dari campuran akan muncul keluar dari kolom berurutan tergantung masa molekul, yang paling besar akan keluar paling dahulu. Senyawa yang sama sekali tidak dapat masuk ke dalam gel akan terpisah satu sama lain. Molekul dengan ukuran intermediate (diantara besar dan kecil) akan tertahan yang lamanya bergantung pada perembesan mereka dalam matriks. Efek adsorpsi pada permukaan butiran gel biasanya dapat diabaikan.

Fasa diam cair adalah cairan yang terdapat dalam matriks ge, sedang fasa gerak adalah eluen yang mengalir yang menempati sisa ruang di kolom.

Teknik analisis

1)    Pemilihan gel

Gel merupakan senyawa yang terdiri dari rantai-rantai polimer panjang berhubungan silang dan membentuk kerangka tiga dimensi. Kebanyakan mempunyai gugus polar yang mampu mengadsorpsi air atau pelarut lain yang polar, ada pula yang mampu mengadsorpsi pelarut lain yang non polar.

Bila suatu gel mengadsorpsi cairan, maka akan terjadi perentangan struktur dan pembukaan dan terjadi penghilangan celah-celah yang terdapat di dalam gel, tergantung pada banyaknya hubungan silang, terdapat pula macam-macam ukuran molekul yang tepat dapat masuk ke ruang dalam gel. Batas-batas ukuran molekul yang dapat masuk disebut Ukuran Kritis (exclusion limit)  yang bervariasi pada berat molekul antara 1000 – beberapa juta.

Untuk dapat memilih gel yang sesuai untuk suatu campuran yang akan dipisahkan perlu diketahui tipe-tipe dari gel seperti :

·    Sephadex untuk pemisahan molekul yang besar dalam biokimia

·    Biogel P untuk molekul dengan bobot molekul 1.800 – 400.000

·    Agarose untuk molekul dengan bobot molekul > 500.000

·    Styragel untuk molekul dengan bobot molekul 1.600 – 40 juta

2)    Pembuatan Kolom

Kolom gel dibuat dengan cara yang sama seperti kolom pertukaran ion. Gel mula-mula dimuaikan dulu dengan pelarut selama beberapa jam, kemudian dimasukkan ke dalam kolom dalam bentuk bubur. Lapisan gel ditopang dengan gelas wool atau jala nilam dan diusahakan tidak ada gelembung udara yang terperangkap di dalam lapisan dengan cara permukaan zat cair di atas lapisan.

3)    Pemasukkan Cuplikan

Sampel dimasukkan secara berhati-hati sehingga tidak merusak lapisan. Elusi biasanya dilakukan di bawah tekanan hidrostatik (atmosfer) yang tetap untuk memperoleh laju aliran yang tetap.

4)    Deteksi

Metode deteksi yang umum meliputi pengumpulan dan penganalisaan fraksi-fraksi eluat. Metode deteksi secara kontinyu dilakukan dengan hasil pemisahan yang dilewatkan wadah-wadah dimana dilakukan pengukura-pengukuran seperti spektrofotometri UV, index bias atau radioaktivitas.

5) Pemakaian

a)  Penghilangan garam (desalting)

Menghilangkan garam dan molekul kecil dari makromolekul dan merupakan masalah umum dalam pemisahan biokimia.

Desalting dengan mudah dapat dilakukan dengan kolom gel yang sederhana dengan laju aliran yang tinggi.

b) Pemekatan

Larutan encer makromolekul dengan Bobot Molekul lebih tinggi dari exclusion limit suatu gel dapat dipekatkan dengan menggunakan sifat higroskopis dari gel kering. Bila gel kering dimasukkan dalam larutan encer maka air dan garam-garam serta molekul yang kecil akan terpisah oleh gel tersebut, sedang makromolekul tertinggal dalam larutan sisa dengan kadar lebih tinggi.

c)  Pemisahan

Untuk senyawa-senyawa berbobot molekul tinggi seperti protein, pestisida, asam nukleat, polisakarida, enzim dan hormon.

d.    KROMATOGRAFI AFINITAS

Dalam sistem ini fasa diam berupa suatu kerangka zat padat yang mempunyai afinitas berlainan dengan berbagai senyawa. Pemisahan terjadi karena komponen hasil reaksi akan dapat melewati keluar sedang komponen yang belum/tidak bereaksi akan tertahan oleh fasa diam. Proses ini digunakan misalnya dalam reaksi enzimatis secara kontinyu. Enzim mula-mula diikatkan pada fasa diam, kemudian zat yang akan direaksikan dialirkan melalui kerangka yang telah mengikat enzim tersebut.

4.    SPEKTROFOTODENSITOMETRI – TLC SCANNER

Analisa kuantitatif dari KLT dapat dilakukan baik pada plat maupun setelah noda komponen  diekstraksi dari plat. Cara mana diantara keduanya yang sebaiknya dipilih, tergantung dari berbagai persoalan analisa yang dihadapi, seperti misalnya keberulangan yang diinginkan, sifat komponen-komponen yang akan dipisahkan dan jumlah cuplikan yang tersedia.

                Salah satu cara analisa kuantitatif yang sering digunakan adalah dengan mengukur transmisi dari noda yang menyerap sinar ultra violet. Pada cara ini, sinar yang diabsorpsi oleh sejumlah tertentu luas lapisan absorben, dimana terdapat noda komponen dibandingkan terhadap  sinar yang diabsorpsi oleh sejumlah sama lapisan absorben yang bersih (tanpa noda komponen). Pada analisa kuantitatif dengan KLT, keberhasilan analisa sangat dipengaruhi oleh ketelitian volume larutan yang ditotolkan, besar titik totolan dan jarak antar totolan serta jarak elusi yang berpengaruh pada besarnya bercak.  Pada pengukuran spektrofotometri secara densitometri, faktor-faktor tersebut akan berpengaruh pada kadar zat yang dianalisa.

                Sumber kesalahan yang lain adalah penggunaan mikrokapiler ukur dan alat penyuntik mikro (microsyringe) dalam hal penotolan larutan uji pada plat lapis tipis. Kesalahan tersebut dapat diatasi menggunakan teknik penyemprotan sampel secara otomatis yang bekerja secara elektronik. Larutan dalam microsyringe disemprotkan pada KLT menggunakan gas nitrogen. Dengan teknik penotolan ini, noda bercak yang terbentuk setelah dielusi diharapkan dapat terpisah dengan baik.

                Noda yang mempunyai sifat dapat mengabsorpsi sebagian sinar, dapat terdeteksi hanya jika bahan plat yang dipakai tidak mengabsorpsi terlalu kuat pada panjang gelombang pengukuran. Pengukuran sinar yang diabsorpsi tidak perlu dilakukan pada seluruh noda. Pengukuran tesebut cukup dilakukan hanya pada sebagian kecil noda saja. Untuk itu harus digunakan lebar celah sinar yang cukup sempit.

                Alat yang dipakai untuk mengukur transmisi sinar ini disebut densitometer  dan prinsip pengukurannya adalah sebagai berikut ini :

                Berkas sinar dengan panjang gelombang tertentu, melalui suatu celah yang sempit, dikenakan dan digerakkan sepanjang plat kromatogram. Pada waktu sinar datang pada lapisan absorban  tanpa noda, maka sinar dipantulkan kembali seluruhnya (gambar). Sebaliknya jika sinar datang pada lapisan absorban, dimana terdapat noda, maka sebagian sinar akan diserap oleh noda. Oleh karena itu, jumlah sinar yang dipantulkan akan berkurang.

                Perbedaan intensitas sinar ini yang diubah oleh detektor menjadi signal listrik dan dicatat oleh pencatat atau rekorder sebagai suatu puncak   seperti pada gambar. Alat densitometer yang telah dilengkapi dengan pencatat dikenal dengan nama TLC – Scanner.

                Luas puncak atau tinggi puncak dari kromatogram ( a ) di atas sebanding dengan intensitas noda komponen yang berarti pula sebanding dengan konsentrasi komponen. Prinsip inilah yang dijadikan dasar analisa kuantitatif.

                Adapun prinsip dari analisa kuantitatif secara spektrofotodensitometri dengan TLC – Scanner adalah plat yang sudah dipisahkan dimasukkan dalam spektrofotodensitometer, kemudian bercak dikenai sumber cahaya atau gelombang elektromagnetik kemudian direfraksi di detektor, direkam dalam rekorder. Dengan mengingat keterbatasan pemisahan senyawa kompleks, pemakaian metode spektrofotodensitometri untuk analisa kuantitatif masih sangat terbatas, tetapi metode ini memiliki berbagai keuntungan, antara lain :

a.    Evaluasi kuantitatif dapat diulang tanpa harus melakukan pemisahan kromatogram lagi. Misalnya selektivitas penetapan dapat diperbaiki   dengan merubah model scanning atau panjang gelombang yang digunakan.

b.    Sensitivitas deteksi dapat lebih ditingkatkan dengan tidak adanya fasa gerak.

c.     Waktu scanning atau pengamatan lebih santai karena dapat dihentikan sewaktu-waktu pada panjang gelombang yang dikehendaki.

               

e.    Instrumentasi

Alat TLC – Scanner mempunyai rancang bangun tertentu, meliputi sumber cahaya, perangkat pemilih panjang gelombang ( monokromator ), detektor, serta rekorder.

1.    Sumber cahaya

Sebagai sumber cahaya digunakan lampu Deuterium untuk daerah ultraviolet

( 200 – 370 nm ), daerah cahaya tampak digunakan lampu Halogen ( 370 – 700 nm ). Apabila pengukuran dengan intensitas yang lebih tinggi digunakan lampu Mercury ( Hg ) atau Xenon. Lampu-lampu tersebut dipilih salah satu sesuai dengan kebutuhan.

2.    Perangkat Pemilih Panjang Gelombang ( Monokromator )

Sumber cahaya yang digunakan biasanya memancarkan radiasi kontinyu pada panjang gelombang yang lebar. Tetapi pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang hampir monokromatis, atau idealnya monokromatis. Maka diperlukan alat yang dapat memisahkan radiasi polikromatis menjadi hampir monokromatis. Ini berupa filler atau monokromator. Bagian-bagian monokromator meliputi :

a)    Celah masuk ( entrance slit )

Tempat masuknya radiasi dari sumber cahaya

b)   Collimator Mirror

Berupa  lensa atau cermin cekung untuk mensejajarkan cahaya

c)    Alat Dispersi

Berupa cermin untuk menguraiakan radiasi panjang gelombang

d)   Concave Mirror

Berupa lensa  atau cermin cekung untuk memfokuskan cahaya

e)   Celah keluar ( exit slit )

Tempat keluarnya radiasi yang hampir monokromatis jatuh tegak lurus menuju sampel (kromatogram).

3.    Detektor.

                   Foton dari  cahaya tampak  atau ultraviolet mempunyai cukup energi untuk melepaskan elektron  dari permukaan senyawa tertentu. Aliran elektron semikonduktor menimbulkan arus listrik sebanding dengan foton yang diserap.

4.    Rekorder

                   Sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor harus diubah menjadi bentuk yang dapat diinterpretasikan. Hal ini dilakukan menggunakann alat  elektronik berupa rekorder atau komputer.

f.     METODE SCANNING

Dalam spektrofotodensitometri terdapat dua macam metode scanning, yaitu :

1)    Linear Scanning ( Slit Scanning )

Gambar Skema Slit Scanning

Berkas sinar berupa  celah panjang ( harus lebih besar dari lebar noda ), memayar  plat KLT ke arah lebar.

2)    Zigzag  Scanning  ( Flying Spot Scanning )

Berkas sinar berupa bujur sangkar, memayar ke kiri – kanan, mencakup keseluruhan bercak sambil maju lurus bertahap ke arah tertentu.

Gambar  Skema Zigzag Scanning

               

Dua cara Scanning tersebut, bukan sumber sinar yang bergerak, tetapi plat KLT yang bergerak. Gerakan ini menurut sumbu X dan sumbu Y, sehingga kebebasan untuk mengatur sebelumnya sesuai dengan tujuan analisa. Noda hendaknya bulat dan teratur agar memberikan hasil dengan satu puncak dan berbentuk simetris, namun umumnya bercak pada kromatogram tidak selalu mempunyai bentu, ukuran dan distribusi yang sama. Bercak bulat dan distribusi konsentrasi uniform, scanning linear sudah cukup. Bercak yang mempunyai bentuk, ukuran dan distribusi konsentrasi yang tidak seragam, scanning linear tidak memberikan pengukuran yang akurat. Bercak yang demikian digunakan cara scanning zigzag.

g.    ANALISIS KUANTITATIF

Luas Area sampel

% Kadar =                                                                     x  % Konsentrasi Standard

Luas Area standar

Atau

                                Luas area sampel          mg baku       Vol. sampel

% Kadar =            ¾¾¾¾¾¾¾    x     ¾¾¾    x  ¾¾¾¾¾  x  100 %                              

Luas area baku                mg spl              Vol.baku

5.    KROMATOGRAFI GAS

Kromatografi gas adalah suatu cara untuk memisahkan senyawa atsiri dengan melewatkan arus gas melalui fasa diam. Bila fasa diam berupa zat padat ® kromatografi gas padat ( GSC ). Didasarkan pada sifat penjerapannya kemasan kolom untuk memisahkan cuplikan teutama cuplikan gas. Kemasan kolom yang lazim dipakai adalah gel adalah silika gel, ayakan molekul dan arang.  Bila fasa diam berupa zat cair ® kromatografi gas cair ( GLC ). Fasa cair disaputkan berupa lapisan tipis pada zat padat pembawa dan pemisahan didasarkan pada partisi, cuplikan yang masuk ke dan keluar dari lapisan zat cair. Banyak fasa cair yang dapat digunakan sampai suhu 400 oC mengakibatkan kromatografi gas cair merupakan bentuk kromatografi gas yang paling serba guna dan selektif.

Keuntungan Kromatografi Gas

a)    Kecepatan

Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengadakan kesetimbangan antara fasa bergerak dengan fasa diam. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.

             Hingga waktu pemisahan sangat cepat ( diukur dalam menit).

b)   Sederhana

Alat kromatografi gas mudah dijalankan dan mudah dipahami. Interpretasi data yang diperoleh cepat dan langsung, serta mudah.

c)    Sensitif

GLC ( Gas Liquid Chromatography ) sangat sensitive. Alat yang paling sederhana dapat mendeteksi konsentrasi dalam ukuran 0,01 % ( = 100 ppm). Alat-alat GLC yang lebih rumit dapat mendeteksi senyawa yang konsentrasinya hanya beberapa ppm. Disebabkan sensitivias yang tinggi dari GLC maka hanya memerlukan sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya dalam ukuran mikroliter.

d)   Pemisahan ( Resolution = performance )

Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan dengan cara-cara lain.

e)   Analisa kualitatif

Dengan membandingkan waktu retensi. Waktu retensi ialah waktu sejak penyuntikan sampai maksimum puncak. Sifat ini merupakan ciri khas cuplikan dan fasa cair pada suhu tertentu. Beberapa senyawa mungkin mempunyai waktu tambat yang saam atau berdekatan, tetapi tiap senyawa hanya mempunyai satu waktu tambat saja. Waktu tambat ini tidak terpengaruh oleh adanya komponen lain.

f)     Analisa kuantitatif

Dengan penghitungan luas puncak. Luas setiap puncak yang terbentuk berbanding lurus dengan konsentrasi puncak tersebut.

g)    Alat GLC ( Gas Liquid Chromatography ) dapat dipakai dalam waktu yang lama dan berulang-ulang.

INSTRUMEN KROMATOGRAFI GAS

       

Gambar Bagan Alat Kromatografi Gas

Dasar kerja GLC adalah sebagai berikut :

Cuplikan diinjeksikan kedalam injektor. Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah teruapkan masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen dari cuplikan. Kemudian komponen-komponen dideteksi oleh detektor dan sinyal dalam bentuk puncak akan dihasilkan oleh pencatat.

Keuntungan cara elusi ini adalah :

1.    kolom terus menerus dipulihkan oleh fasa gas pembawa

2.    biasanya komponen cuplikan terpisahkan secara sempurna dan hanya tercampuri oleh gas pembawa sehingga pengumpulan dan penentuan kadar menjadi lebih mudah.

3.    waktu analisis pendek.

Kekurangannya adalah :

Komponen yang tertahan kuat akan bergerak sangat lambat, atau dalam beberapa kasus tidak bergerak sama sekali.

1.    Gas pengangkut

Gas pengangkut ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi (biasanya 150 atm). Gas yang sering digunakan : He, Ar, H2, N2

Pemilihan gas sebagai gas pembawa tergantung dari tipe detektor yang digunakan.

Tipe detektor	Gas pembawa
TCD	H2, He, Ar dan N2
FID	N2, Ar, He
FPD	N2, He
FTD / NPD	He, N2
ECD	N2, Ar + 10 % CH4

Syarat gas pengangkut :

a.    harus inert, tidak bereaksi dengan cuplikan, pelarut dan material dalam kolom.

b.    murni dan mudah diperoleh.

c.     sesuai/cocok untuk detektor.

d.    harus mengurangi difusi gas sehingga diperoleh koefisien difusi rendah.

2.    Pengatur tekanan dan pengatur aliran

             Disebut pengatur atau pengurang Drager. Drager bekerja baik pada 2,5 atm, dan mengalirkan massa aliran dengan tetap. Tekanan lebih pada tempat masuk kolom diperlukan untuk mengalirkan cuplikan masuk kedalam kolom. Suhu kolom tetap diatur oleh thermostat, maka aliran gas tetap yang masuk kolom akan tetap juga. Juga komponen-komponen akan dielusikan pada waktu yang tetap disebut waktu penahanan (the retention time), tR. Karena kecepatan gas tetap, maka komponen juga mempunyai volume karakteristik terhadap gas pengangkut = volume penahanan (the retention volume), VR.  Kecepatan gas akan mempengaruhi efisiensi kolom.

Harga-harga yang umum untuk kecepatan gas untuk kolom yang memiliki

diameter luar :   ¼ inch                                                                                     

kecepatan gas : 75 ml / menit

1/8 inch   : kecepatan gas 25 ml / menit

Laju aliran optimum dapat ditentukan dengan berdasarkan percobaan, denagn membuat grafik Van Deemter, H vs kecepatan gas linier. Laju aliran yang paling efisien ialah pada H minimum atau pelat maksimum

3.    Tempat Injeksi

             Cuplikan harus dalam bentuk fasa uap. Gas dan uap dapat dimasukkan secara langsung. Kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan dan padatan, untuk itu perlu diuapkan dulu. Ini perlu pemanasan sebelum masuk dalam kolom. Panas itu terdapat pada tempat injeksi. Suhu tempat injeksi sekitar 50 oC lebih tinggi dari titik didih campuran dari cuplikan yang mempunyai titik didih yang paling tinggi. Suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena pana atau peruraian dari senyawa yang akan dianalisa. Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui tempat injeksi dengan pertolongan jarum injeksi yang sering disebut “ a gas tight syringe “. Karena GLC sensitive, maka cuplikan tidak boleh diinjeksikan terlalu banyak. Biasanya diinjeksikan 0,5 – 50 µl untuk gas dan 0,2 – 20 µl untuk cairan, padat terlarut 0,1 – 3 mg.

4.    Kolom

Bentuk dari kolom dapat lurus, bengkok misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral. Biasanya bentuk dari kolom adalah kumparan. Kolom selalu merupakan tabung.

Tabung dapat terbuat dari :

· Tembaga (murah dan mudah diperoleh), bereaksi dengan amina, asetilen, steroid, terpen.

·  Plastik (Teflon) dipakai pada suhu yang tidak terlalu tinggi.

·  Baja (stainless steel), mahal

·  Aluminium

·  Gelas

Panjang kolom dapat dari 1 m sampai 3 m. Diameter kolom mempunyai berbagai ukuran, biasanya pengukuran berdasarkan diameter dalam dari kolom gelas yaitu 0,3 mm hingga 5 mm. Kebanyakan kolom yang digunakan berupa stainless steel dengan diameter luar (OD) dari 1/8 atau ¼ inch ( 0,3 atau 0,6 cm ). PAda GSC, kolom diisi dengan penyerap (adsorbent), sedangkan GLC, kolom diisi dengan “solid support” (padatan pendukung) yang diikat oleh fasa diam.

a.    Jenis kolom

Volum cuplikan untuk berbagai kolom :

Jenis kolom	Ukuran Cuplikan
	Gas	Zat cair
Preparatif DL 1”, fasa cair 20 %	0,05 – 5 liter	0,02 – 2 ml
Analisis biasa DL ¼ “,fasa cair 10 %	0,5 – 50 ml	0,2 – 20 ml
Sangat efisien DL 1/8 “, fasa cair 2 %	0,1 – 10 ml	0,04 – 4 ml
Kapiler DL 1/6 “,lapis tipis 5,0 m	0,1 – 10 ml	0,004 – 0,5 ml

Pada dasarnya kolom kromatografi gas dibedakan menjadi dua yaitu :

1)    Kolom kemas, mempunyai ukuran panjang 1 – 4 m dan diameter dalam 1,6 – 9,5 mm.

2)    Kolom kapiler, mempunyai ukuran panjang 10 – 100 m dengan diameter dalam berkisar 0,2 – 1,2 mm.

Kolom kapiler dibagi menjadi dua yaitu kolom “micro packed” dan “open tubular”.

Tiga tipe kolom “open tubular” yaitu :

·      SCOT            : Solid Coated Open Tubular

·      PLOT            : Porous Layer Open Tubular

·      WCOT          : Wall Coated Porous Tubular

WCOT adalah tipe kolom yang banyak digunakan dengan ukuran panjang 10 – 30 m, diameter dalam 0,53 mm dan tebal lapisan 1 – 2 mm.

Tipe kolom dan jumlah pelat teori (N)

Jenis kolom	Dimensi	Jumlah pelat teori (N)
Kolom kemas	2 m x 2,1 mm 4 m x 2,1 mm	7000 14000
Kolom “wide bore”	10 m x 0,53 mm 25 m x 0,53 mm 100 x 0,53 mm	11000 26000 10000
Kolom kapiler	25 x 0,53 mm	110000

                                                                                                                                  

Gambar Kolom Kemas

Gambar Kolom kapiler

b.  Isi kolom

1)    Padatan pendukung

                         Padatan pendukung berfungsi mengikat fasa diam.Kebanyakan zat ini berupa tanah diatomae yang telah dipanaskan/dikeringkan. Padatan pendukung mempunyai luas permukaan yang besar yang dibutuhkan untuk mendistribusi fasa diam yang bersifat cairan dalam CLC.

Persyaratan dari padatan pendukung yang baik :

a)    Inert (tidak mengerp cuplikan).

b)    Kuat, stabil pada suhu suhu yang tinggi.

c)     Memiliki luas permukaan yang besar 1 – 20 m2/g.

d)    Permukaan yang teratur, ukuran yang sama : ukuran pori sekitar 10 m.

e)    Harus mempunyai tahanan yang rendah terhadapgas pengangkut.

Padatan pendukung yang biasa digunakan adalah Keisulguhr (forementionned-diatomaceus earth). Nama dalam perdagangan :

·      Diatoport

·      Celite

·      Chromosorb

Padatan pendukung ini terutama terdiri dari SiO2

                                91 % - SiO2

5 % - Al2O3

 2 % - Fe2CO3

0,5 % - CaO dan oksida oksida lainnya

Yang paling penting adalah Chromosorb. Ada beberapa jenis Chromosorb

·      Chromosorb G  : luas permukaannya kecil (0,5 m2/g),hingga hanya dapat digunakan untuk mengikat fasa cair dalam jumlah yang sedikit ( ± 5 % ), merupakan materi yang sangat keras; baik untuk pemisahan senyawa-senyawa polar.

·      Chromosorb P  :     berwarna kemerah-merahan (P=pink); digunakan untuk senyawa-senyawa yang apolar terutama hidrokarbon.

·      Cromosorb W   :     berwarna putih, agak mudah hancur, terutama digunakan untuk senyawa senyawa polar.

Ukuran dari padatan pendukung yang digunakan adalah :

·       untuk kolom 1/8 inch : 100/120 atau 80/100 mesh

·       untuk kolom ¼ inch : 60/80 atau 40/60 mesh.

100/120 mesh » 0,15 – 0,13 mm ; 80/100 mesh » 0,18 – 0,15 mm

60/80 mesh » 0,25 – 0,18 mm ; 40/60 mesh » 0,40 – 0,25 mm

Deaktivasi permukaan padatan pendukung pada kolom kapiler dilakukan karena adanya gugus silanol pada permukaan silika gel merupakan problem, bila senyawa yang akan dipisahkan merupakan senyawa-senyawa polar (alkohol-alkohol atau hidrokarbon aromatis) akan teradsorpsi oleh gugus-gugus silanol tersebut sehingga kan mempengaruhi ke hasil kromatogram, akan terjadi peak brodening atau peak tailing.

    OH              OH            OH                      OH   OH                OH

                  O                   O                     O                 O                 O

      Si                 Si                       Si                       Si                      Si                  Si

Deaktivasi padatan pendukung dilakukan dengan Reaksi Silanisasi :

                                   CH₃                                         CH₃

- Si – OH + Cl – Si – Cl ® - Si – O – Si – Cl + HCl

                                                   CH₃                                         CH₃

                     CH₃                                                                                      CH₃

 - Si – O – Si – Cl + CH₃ – OH ®  - Si – O – Si – OCH₃ + HCl

                     CH₃                                                                              CH₃

(Silanisasi)

Fused silica capillaries ( Highly purified materials)

2)    Fasa Diam

Dalam GLC fasa diam berupa cairan. Pada fasa cairan ini pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi. Dasar kerja adalah Partisi antara fasa caian dan fasa gerak (gas).

Persyaratan untuk fasa cair yang baik adalah sebagai berikut :

a)    Cuplikan-cuplikan harus menunjukkan koefisien distribusi yang berbeda.

b)   Cuplikan-cuplikan harus mempunyai kelarutan tertentu dalam pelarut (fasa cair).

c)    Fasa cair harus mempunyai tekanan uap yang sangat rendah pada suhu-suhu yang tinggi : 0,01 – 0,1 mm Hg.

d)    Secara kimia harus stabil dan inert.

e)    Harus mempunyai kekentalan yang rendah, sehingga tidak mengikat gas.

f)     Harus dengan baik tersebar dan mengikat pada padatan pendukung.

g)    Harus larut dengan baik pada pelarut organik yang mempunyai titik didh rendah.

Beberapa fasa cair yang digunakan

Fasa cair	Jenis cuplikan	Polaritas	Suhu maksimum
Squalene	Hidrokarbon	Non polar	125 oC
Metilsilikon	Steroid, Peptida, Alkaloida, Ester	Non polar	300 oC
Sianosilikon	Semua jenis	Agak polar	275 oC
Resin poliamida	Senyawa amino	Polar	300 oC
Carbowax 20	Alkohol, amino aromatik,keton	Polar	250 oC

Pemilihan fasa diam didasarkan pada cuplikan-larutan dalam fasa cair. Dengan kata lain dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk memperoleh pemisahan yang baik. Sehingga senyawa polar akan terpisah dengan baik pada fasa cair yang polar dan senyawa senyawa non polar akan terpisah dengan baik pada fasa cair yang non polar.

c.   Suhu Kolom

Suhu kolom harus cukup tinggi sehingga analisis dapat diselesaikan dalam waktu yang layak dan harus cukup rendah sehingga pemisahan yang dikehendaki tercapai.

Aturan umum :

Kenaikan 30 oC dapat menurunkan ½ harga k sehingga menurunkan ½ dari tR  menyebabkan waktu analisis akan turun.

Jadi suhu kolom yang baik adalah :

·      Harga rata-rata dari titik didih sampel

-     Di atas titik lebur dari sampel

-     Tergantung dari % fasa cair pada padatan pendukung

-     Di bawah suhu maksimum kolom

d.  Dasar kerja kolom

Dasar kerja kolom dalam GLC adalah pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi di antara gas pengangkut dan fasa cair. Proses pemisahan dapat dipandang sebagai serangkaian dari partisi dimana cuplikan masuk ke dalam larutan dari fasa dan selang waktu akan teruapkan lagi. Di dalam GLC harus diketahui juga tentang waktu penahanan ( the retention time ) = tR   yaitu waktu dimana cuplikan ditahan oleh fasa diam.

e.  Kromatografi gas suhu konstan (Isotermal)

Kromatogram gas biasnya diperoleh dengan kolom yang dijaga pada suhu konstan (isotermal). Kerugiannya :

·      puncak-puncak awal tajam, berimpitan (resolusi jelek), puncak-puncak akhir rendah, melebar.

·       Senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi sering tidak terdeteksi (utamanya : campuran yang tidak diketahui komposisinya dan rentang titik didihnya lebar)

·      Untuk itu dihindari dengan ”PROGRAM SUHU”

f.   Kromatografi gas suhu terprogram

Kelebihan  :

·      mengijinkan pemisahan senyawa dengan rentang titik didih yang luas jauh lebih cepat dibanding teknik isotermal.

·      Puncak-puncak kromatogram lebih tajam/ramping dan bentuknya lebih seragam, dengan demikian :

5.   Detektor

Pada detektor, komponen-komponen cuplikan yang telah terpisah dideteksi. Ciri detektor yang dikehendaki adalah :

·  kepekaannya tinggi

·  tingkat deraunya rendah

·  kelinieran tanggapannya lebar

·  tanggap terhadap semua jenis senyawa

·  kuat

·  tidak peka terhadap perubahan aliran dan suhu

·  harganya murah

Dua macam detektor yang populer :

a)    Detektor hantaran panas ( The Thermal Conductivity Detector = TCD ) juga disebut Katharometer.

b)   Detektor ionisasi nyala ( The Flame Ionisation Detector = FID )

c)    Detektor mengubah sejumlah sifat-sifat molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik. Arus ini diteruskan ke pencatat untuk menghasilkan kromatogram.

d)   Komponen merupakan gambar dari jawaban (respon) detektor vs waktu.

Sehingga detektor memberikan data :

a)    Kualitatif : mendeteksi ada beberapa komponen terelusi

b)   Kuantitatif  : kebanyakan luasan dari puncak yang terelusi sebanding dengan massa komponen yang terelusi.

Detektor hantaran panas (TCD) peka terhadap konsentrasi, tetapi juga tergantung pada kecepatan dari gas pengangkut. Hingga untuk analisa kuantitatif yang teliti kecepatan gas pengangkut harus dibuat tetap.

Keuntungan TCD :

·  tidak merusak cuplikan

·  semua macam molekul dapat dideteksi

Kekurangan TCD :

a.      kurang sensitif, biasanya 6 x 10 –10 g / det

b.     FID hampir peka terhadap semua senyawa, kecuali H2O, CS2 dan beberapa gas (gas mulia, O2, N2). FID tidakmemberikan puncak udara. FID sangat tergantung pada kecepatan alir gas.

Kecepatan alir gas yang paling baik adalah :

Gas pengangkut     N₂         :               30 ml/min            atau dengan perbandingan 1 : 1 : 10

H₂          :               30 ml/min

Udara :               300 ml/min

Keuntungan FID :

sangat sensitif »  9 x 10 –13 g/det ® ± 1000 x lebih sensitif daripada TCD, perbandingan jumlah minimum yang dapat dideteksi oleh :

FID ~ 2.10 –11

TCD ~ 1.10-5

Kerugian FID

cuplikan harus dibakar, sehingga cuplikan menjadi rusak.

6.   Rekorder

Alat ini berupa gawai listrik mekanik untuk menghasilkan krpmatogram. Untuk menghasilkan hasil kuantitatif yang teliti, harus dicek tentang kelinieran, rentang, kecepatan pena, pita mati dan nol listrik.

7.   Suhu Pada GLC / Termostat

Ada tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam GLC

a.    Suhu tempat injeksi

                   Disimpulkan sebagai berikut :

1)    Harus cukup tinggi untuk menguapkan cuplikan. Biasanya = 50 oC lebih tinggi daripada titik didih dari komponen cuplikan. Harus dicoba hingga diperoleh bentuk puncak yang paling baik.

2)    Tidak telalu tinggi sebab kalau terlalu tinggi akibatnya kemungkinan terjadinya perubahan oleh panas atau peruraian dari molekul-molekul.

b.    Suhu kolom

1)    Dalam semua hal : di atas titiklebur dari fasa cair, tetapi di bawah suhu maksimum yang diperbolehkan dari fasa cair.

2)    Dalam praktek suhu kolom berdasarkan atas kompromi.

Suhu suhu yang lebih rendah memberikan pemisahan lebih baik, tetapi waktu retensi lebih panjang.

3)  Waktu retensi menjadi lipat dua untuk setiap 30 oC penurunan suhu kolom.

c.     Suhu detektor

Cukup tinggi untuk mencegah kondensasi dari cuplikan. Keadaan ini dapat dilihat pada kromatogram dengan adanya pelebaran puncak atau hilangnya puncak.

Dengan TCD (The Thermal Conductivity Detector), suhu detektor harus tetap dijaga, tetap ± 0,1 oC.

Untuk FID ( The Flame Ionisation Detector), pengontrolan suhu tidak begitu penting.

1.    Derivatisasi

Beberapa sampel tidak dapat langsung diinjeksikan pada Kromatografi gas, karena :

·  polaritasnya tinggi

·  volatilitasnya rendah

·  tidak stabil terhadap panas

Untuk itu dibuat derivat yang volatil, umumnya dengan pereaksi sililasi dengan Si(CH3)3 atau special silyating agents yang mengandung Cl, Br.

Derivatisasi pada kromatografi gas bertujuan untuk :

·  merubah struktur molekul atau polaritas analit untuk tujuan kromatografi yang baik

·  untuk menstabilkan analit

·  untuk meningkatkan kemampuan deteksi

·  untuk merubah matriks guna pemisahan yang lebih baik

Reaksi derivatisasi sebaiknya :

·  cepat dan kuantitatif

·  hasil samping seminimal mungkin

· kelebihan pereaksi harus tidak mengganggu analit atau mudah dihilangkan dari campuran

Pada kromatogram gas normal, tidak ada puncak-puncak kecil, tetapi berupa bentuk-bentuk kurva yang disebut kurva-kurva Gauss (pelebaran puncak), bila keadaannya lebih jelek akan menghasilkan puncak-puncak berekor atau pemanjangan di muka.

Hal ini disebabkan adanya :

a.    Difusi Eddy (olakan) : difusi ini disebabkan oleh kenyataan bahwa kecepatan gas pengangkut tidak sama di dalam seluruh kolom. Ini disebabkan oleh kenyataan, bahwa bagian-bagian dari pori yang dilalui tidak sama panjang “Multipath Effect” (pengaruh jalan berganda).

b.    Difusi molekular : terutama dalam fasa gas, molekul-molekul cuplikan dapat bergerak dalam arah yang salah disebabkan oleh difusi.

c.     Kesetimbangan yang lambat : beberapa molekul tetap tinggal lama, lainnya sebentar dalam fasa diam (hal ini disebabkan oleh perbedaan-perbedaan suhu yang kecil).

d.    Harga k tidak tetap : disebabkan perbedaan rasio distribusi dalam kolom.

Keempat faktor ini menyebabkan perbedaan puncak.

Faktor 1,2,3 memberikan pelebaran puncak yang simetris.

Faktor 4 menyebabkan pelebaran puncak yang tidak simetris.

Pelebaran-pelebaran puncak terjadi dalam berbagai metoda analisa. Dalam keadaan yang paling buruk dapat menyebabkan puncak saling tumpang tindih.

Pemisahan R (resolution) adalah pemisahan nyata antara dua puncak berdekatan :

                                               

2d

                                   R = ¾¾¾¾         dalam hal dua puncak dengan luas sama

                                          W1 + W2

Jika R = 1 pemisahan adalah 98 %

Untuk pemisahan yang baik R harus : R ≥ 1,5 ini berarti pemisahan ≥ 99,7 %.

Pemisahan dari puncak-puncak dalam kromatografi erat hubungannya dengan dua faktor :

a.    Efisiensi kolom : pelebaran puncak merupakan hasil dari bentuk kolom dan kondisi operasi.

b.    Efisiensi pelarut : hasil dari interaksi cuplikan dengan fasa diam, efisiensi pelarut menentukan kedudukan relative dari jalur-jalur solue pada sebuah kromatogram.

a.    Efisiensi Kolom

Efisiensi kolom diukur sebagai jumlah pelat teoritis : N

L

HETP = ¾¾

N

N = jumlah pelat teoritis dari suatu kolom

L = panjang (cm) dari kolom tersebut

                   Efisiensi kolom tergantung pada :

·      pelarut = fasa diam

·      solut/zat yang dilarutkan = cuplikan

·      suhu

·      kecepatan aliran (dari gas pengangkut)

·      ukuran dari cuplikan

a.    Teori Pelat

Pelat atau lebih baik HETP, adalah tinggi (atau panjang) dari kolom yang cukup untuk tercapainya kesetimbangan antara solut dalam fasa gerak dan fasa cair yang tetap. Lebih banyak pelat yang dimiliki oleh kolom, akan memberikan puncak yang lebih kecil, atau efisiensi lebih baik.                                                                

                   Pelat teoritis berhubungan dengan pelebaran puncak pada kromatogram.

                       

L         s2

HETP = ¾¾ = ¾¾  L

N          x2

N =  16 ( x/y)2  ini berasal dari N = (x/s) 2  dimana y = 4s

                   X =   jarak dari injeksi ke puncak maksimum

Y =   panjang dari garis dasar terpotong oleh tangen-tangen dari kurva pada titik-titik

pertemuan (biasanya 2/3 dari tinggi)

                   s =   deviasi standar

b.    Teori Kelajuan / Kecepatan

Teori kelajuan dikembangkan oleh Van Deemter, bentuk persamaan tersebut :

HETP = A + B/µ + Cµ

µ : kecepatan linier gas (atau kelajuan aliran) melalui kolom :

panjang kolom (cm)

µ =             ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾

waktu penahanan udara (det)

A : difusi olakan ( the eddy diffusion = efek jalan ganda)

B : difusi molekular : pendefusian solut dalam gas pengangkut

C : penahanan terhadap perpindahan massa

Ini adalah ukuran dari jumlah atau kekentalan dari fasa diam (cair) di dalam kolom. Jika harga-harga A, B dan C tertentu, maka kita dapat melihat persamaan dasar Van Deemteer harus terdapat kecepatan kelajuan gas pengangkut optimum, dimana akan bekerja pada keadaan tersebut.

                        µopt = HETPopt

                        Jika digambarkan :

                       

HETP = A + B/µ + Cµ

HETPmin = A + 2 Ö B.C

       

Untuk meningkatkan efisiensi kolom :

a.    Padatan pendukung harus terbuat dari partikel-partikel yang kecil, ukurannya sama

b.    Kecepatan alir gas pengangkut adalah optimum pada HETPopt

c.     Gas pengangkut BMnya besar, biasanya N2

d.    Fasa diam yang digunakan harus mempunyai kekentalan rendah.

e.    Jumlah fasa diam yang dipakai biasanya 1 – 10 % berat padatan pendukung.

f.     Perbandingan antara gas pengangkut yang masuk dan keluar harus rendah tekanan yang masuk 1,5 – 2,5 atm.

g.    Pemisahan akan lebih baik pada suhu kolom yang rendah ® analisa lama.

h.    Diameter kolom kecil ® pemisahan baik ( 1/8 atau 1/16 inch ).

b.    Efisiensi Pelarut

Efisiensi pelarut didefinisikan sebagai perbandingan dari koefisien-koefisien partisi, atau waktu-waktu retensi yang teratur.

               

x1, x2    : waktu retensi (volume) dari puncak 1,2

x1’, x2’ : waktu retensi terkoreksi atau diatur dari puncak 1,2

Efisiensi pelarut, a = x2’ / x1’ = k2/k1

Koefisien distribusi (=partisi),k , tergantung pada suhu.

Harga k turun dengan kenaikan suhu, karena molekul-molekul akan lebih lama berada dalam fasa gas pada suhu yang lebih tinggi.

Untuk menghitung jumlah teoritis yang dibutuhkan, juga menentukan panjang kolom yang diperlukan adalah :

a                 k2’ + 1

          N yang dibutuhkan = 16 R2 ( ¾¾¾ ) 2 (¾¾¾¾ ) 2

a - x                      k2’

           

                   R                          : pemisahan (resolution)

                   a                         : efisiensi pelarut

k2’                      : faktor kapasitas

 waktu retensi terkoreksi

  ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾

 waktu retensi udara

Pemakaian umum KGC:

·    pemisahan dan identifikasi semua tipe senyawa organik volatile

·    penentuan kualitatif dan kuantitatif

·    dapat menentukan konformasi molekul (isomer) dan stereoisomer

·    dapat diautomatisasikan

Penggunaan lazim

·      pemisahan snyawa dalam campuran dan deteksi untuk identifikasi kualitatif dan kuantitatif

·      digunakan dalam industri untuk analisis bahan dasar, intermediet atau produk akhir

·      digunakan dalam pemakaian di lingkungan, forensik, farmasi dan klinik/kedokteran

Kromatografi gas telah digunakan secara berhasil terhadap sejumlah besar senyawa-senyawa dalam berbagai bidang baik terhadap senyawa organik maupun anorganik. Bahkan senyawa logam sebagai khelat yang mudah menguap dapat ditangani secara memuaskan. Persyaratan yang dibutuhkan hanya tekanan uap yang cocok pada suhu saat analisa akan dilakukan.

ANALISIS KROMATOGRAFI GAS

1.    Analisis kualitatif

                Tujuan dari analisa kualitatif pada GLC adalah identifikasi dari suatu komponen atau lebih dari duatu cuplikan. Jika ingin menguji dua senyawa adalah sama dengan GLC maka diperlukan :

·      melakukan analisa dua kali pada dua kolom yang berbeda.

·      Dua analisa yang lain pada suhu yang berbeda.

                Bila kemudian ternyata didapatkan bahwa waktu waktu retensinya sama, maka kita dapat mengatakan bahwa dua senyawa adalah sama.

Waktu retensi dari suatu senyawa dapat diulang dengan hasil yang sama, tetapi waktu retensi yang tidak terkoreksi jarang digunakan karena tergantung dari panjang dan diameter kolom, fasa cair, suhu kolom, kecepatan aliran, jenis gas pembawa, “dead volume” dari peralatan, sehingga yang paling baik adalah menggunakan waktu retensi relatif.

2.    Analisa kuantitatif

                Analisa kuantitatif dalam GLC berarti menentukan jumlah ( % ) dari komponen komponen yang terpisah dari suatu cuplikan. Respon detektor dibuat nyala oleh pencatat, dapat diubah menjadi konsentrasi/berat dari suatu komponen dari cuplikan. Hal hal yang perlu dilakukan dalam analisa kuantitatif adalah :

a.    Cara cara pengukuran puncak

            Dengan cara mengukur ketinggian puncak dan mencari luas puncak

b.    Faktor faktor koreksi

c.     Standarisasi, digunakan dua cara :

1)    Eksternal

Dengan cara jumlah yang pasti dari cuplikabn murni diinjeksikan. Harga dari luasan puncak kemudian digambarkan lawan berat berat senyawa yang diketahui yang diinjeksikan hingga diperoleh kurva kalibrasi. Kelinieran dari sistem untuk larutan berarti bahwa :

Area/luas

Konstanta (C) = ¾¾¾¾¾¾

Konsentrasi

Konsentrasi dari cuplikan yang tidak diketahui :

Luas terukur

Konsentrasi = ¾¾¾¾¾¾

Konstanta (C)

2)    Internal

Mempunyai keuntungan yang utama yaitu bahwa kita tidak memerlukan volume yang diketahui untuk diinjeksikan .

Caranya adalah sebagai berikut :

Tambahkan pada cuplikan dengan berat yang tepat sejumlah standar internal, juga berat yang tepat dengan konsentrasi kira-kira sama (biasanya 10 %)

Tentukan faktor koreksi dalam suatu analisa yang terpisah, untuk semua komponen yang diukur.

Persen berat dari setiap komponen cuplikan dapat dihitung dengan :

                                                      Luas senyawa x berat standar internal x 100

                        % berat = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾

                                                faktor koreksi x luas standar internal x berat cuplikan

d.    Kesalahan kesalahan dalam analisis

Kemungkinan kesalahan kesalahan pada analisis dapat timbul sari :

·  Cara penyiapan cuplikan

·  Penampilan detektor

·  Cara kuantitatif

·  Penghitungan

UJI KESESUAIAN SISTEM

Merupakan suatu aplikasi umum pada instrumen kromatografi gas.Konsep uji kesesuaian sistem tersebut berdasarkan bahwa baik sistem instrumen,pereaksi, kondisi percobaan,metode analisis, contoh maupun analisis adalah merupakan sistem yang harus diuji fungsinya. Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah suatu sistem kromatografi gas yang digunakan memenuhi syarat yang telah ditentukan sehingga mutu data yang dihasilkan dapt dipercaya dan dipertanggungjawabkan. Menurut FI Ed IV data kesesuaian sistem diperoleh dari hasil penyuntikan berulangkali ( 5 – 6 kali ) baik dari larutan baku maupun larutan uji. Dilakukan sebelum kromatografi gas digunakan. Parameternya meliputi presisi, faktor ikutan (tailing factor), resolusi, efisiensi kolom dan waktu retensi relatif.

6.    KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan pengembangan dari kromatografi kolom,mekanisme pemisahan yang terjadi pada fasa diam dari kromatografi dengan cara berbeda-beda. Pemisahan sangat tergantung hubungan antara fasa diam dan senyawa yang diuji atau linarut. Kromatografi kolom sevara umum dikenal sebagai kromatografi yang mempunyai fasa diam padatan atau solid, dan fasa gerak cairan,sehingga disebut Liquid solid chromatography, atau LSC. Kromatografi kolom pada umumnya digunakan untuk pemisahan secara kasar sehingga hasil yang didapatkan belum murni. Dari kromatografi kolom (LSC) dikembangkan dengan sistem tertutup, perpindahan massanya semula hanya karena gravitasi,kemudian dikembangkan dengan menggunakan tekanan, karena itu namanya disebut High Pressure Liquid Chromatography atau HPLC.

Perkembangan teknologi turut mempengaruhi penampilan HPLC ini seperti otomatisasi, komputerisasi maka penampilan alat pemisahan ini lebih banyak difungsikan sebagai alat analisis dan mempunyai penampilan yang mengagumkan,sehingga HPLC menjadi High Performance Liquid Chromatography

HPLC diterjemahkan menjadi Kromatografi Cair Tekanan Tinggi atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).Semula kegunaan dan tipe KCKT terutama untuk analissi kemudian kegunan untuk pemisahanpun dikembangkan, maka faktor yang sangat berpengaruh dalam mekanisme pemisahan selalu terjadi,seperti :

a.   daya serap zat atau kapasitas fasa diam

b.   ukuran partikel fasa diam

c.    bentuk susunan partikel fasa diam

d.   sifat pelarut

e.   kelarutan cuplikan dalam pelarut

b.   kecepatan fasa gerak dalam kolom

c.    suhu sistem kromatografi

Dari faktor-faktor tersebut didapatkan rumus :

Cs

KD = ¾¾

Cm

KD : koefisien distribusi

Cs : kadar senyawa dalam fasa diam

Cm : kadar senyawa dalam fasa gerak

Atas dasar rumus di atas,dua zat atau lebih dapat dipisahkan dengan kromatografi kolom bilaharga KD masing-masing senyawa jauh berbeda. Perbedaan harga KD, akan menghasilkan daya tambat untuk setiap analit atau linarut (senyawa yang dianalisis) berbeda sehingga dapat terpisah dengan sempurna,tetapi rumus senyawa yang hampir mirip dan daya tambatnya tidak jauh berbeda akan sulit dipisahkan dengan cara kromatografi.

       

Bila digambarkan pita pemisah yang ada di dalam kolom adalah sebagai berikut :

Daya pisah dapat dirumuskan sebagai berikut :

2 ( t2 – t1 )

R = ¾¾¾¾¾¾

( W1 + W2 )

t1     : adalah waktu tambat puncak 1

t2     : adalah waktu tambat puncak 2

W1   : lebar alas puncak 1

W2   : lebar alas puncak 2

Daya tambat sangat tergantung kemampuan interaksi antara linarut dengan fasa diam, kemampuan interaksi tersebut menimbulkan kemampuan memilih dari fasa diam terhadap linarut yang ketetapannya dinamakan a, atau selektivitas. Faktor ukuran dan bentuk partikel fasa diam akan menentukan kemampuan menampung linarut.

A.   INSTRUMENTASI HPLC

Secara umum diagram sistem HPLC dapat terlihat sebagai berikut :

Gambar Bagan Alat KCKT

Perangkat KCKT terdiri dari beberapa unit utama :

·     Solvent delivery sistem atau lebih mudah dikenal dengan pompa, bagian yang dapat menimbulkan tekanan tinggi pada seluruh sistem

·     Reservoir fasa gerak

·     Injektor, merupakan sistem yang dipergunakan untuk menempatkan dan memasukkan sample/cuplikan yang akan dianalisis

·     Sistem pemisah, adalah bagian dari system yang berfungsi untuk memisahkan campuran menjadi komponen-komponen penyusunnya (fasa diam dan fasa gerak)

·     Detektor, merupakan bagian dari system yang berfungsi untuk mendeteksi komponen-komponen senyawa yang telah berhasil dipisahkan (ultraviolet, refractive index, fluoresensi)

·     Integrator, adalah bagian yang berfungsi untuk memproses signal bentuk “peak peak”, berikut luas daerah di bawah puncak atau tinggi puncak

1.    Solvent Delivery System

a.    Karakteristik Sistem Pompa

KCKT merupakan suatu kesatuan sistem yang dilengkapi dengan pompa yang mampu memberikan tekanan tinggi. Adanya tekanan tinggi tersebut dapat mempertinggi efisiensi pemisahan campuran senyawa yang dipisahkan. Sistem pompa yang akan digunakan adalah suatu sistem pompa yang dapat dilakukan pengaturan kecepatan alir (“flow rate”), volume, tekanan secara mantap serta tidak menimbulkan gelombang udara. Pompa yang baik untuk kelengkapan KCKT adalah pompa yang dapat dilakukan pengaturan limit tekanan; baik tekanan maksimum maupun minimum.

b.    Kriteria Pompa Yang Baik :

1)    flow rate (kecepatan alir) fase gerak harus stabil ( 0,2 – 2 ml/menit atau bahkan 0 – 10 ml/menit).

2)    Adanya perbedaan kecepatan alir akan menyebabkan penyimpangan pada resolusinya (waktu retensi, luas puncak atau tinggi puncak).

3)    Harus mudah pengaturannya.

4)    “Pulseless flow”

5)    Hal ini penting dalam mempertahankan kestabilan integrator terutama pada analisis pelacakan.

6)    Dapat dioperasikan pada tekanan tinggi ( 3000 – 6000 psi )

7)    Tahan terhadap bahan kimia

8)    Dapat ditentukan batas maksimal tekanan

9)    Dapat diatur untuk penggunaan “Gradient elution”

10)     Tekanan system dapat diketahui setiap saat

11)     Mempunyai “dead volume” yang rendah

12)     Sistem HPLC dapat dioperasikan dengan suhu yang bervariasi

13)     Mempunyai wadah fasa gerak (reservoir) yang relative besar dan mudah diisi

14)     Mudah dilakukan penggantian fasa gerak

15)     Kecepatan alir dapat diatur dengan rentang lebar

2.   Fase Gerak

Pelarut untuk KCKT dan harga P’nya diukur dari data kelarutan oleh Rohrshneider dan diterapkan oleh Sydner.

Fasa Normal		Fasa Balik
Pelarut	P’	Pelarut	P’
Heksana	0,1	Air	10,2
1 Klorobutana	1,0	DMSO	7,2
Isopropil eter	2,4	Etilenglikol	6,9
Metilen klorida	3,1	Asetonitril	5,8
Kloroform	4,1	Metanol	5,1
Etanol	4,3	Aseton	5,1
Etil asetat	4,4	Etanol	4,3
Metanol	5,1	Tetrahidrofuran	4,0
Asetonitril	5,8

Pelarut yang digunakan perlu berderajat kemurnian yang tinggi, karena makin banyak kontaminan yang ada (kualitatif maupun kuantitatif) dapat mempengaruhi interpretasi peak (puncak) yang timbul.

Pemilihan fasa gerak didasarkan atas berbagai macam faktor antara lain sistem, compatibility, kolom, sistem elusi, kelarutan sample, kualitas solvent, air.

Pelarut ini tidak menyerap sinar UV secara berarti dengan demikian dapat dipakai dengan detektor UV l 254 nm.

Kepolaran campuran dua sembarang pelarut dapat dihitung dengan rumus :

P’ = fa   + fb.P’b

fa : fraksi volum pelarut A                               P’a  dan P’b  : angka P’ pelarut murni

fb : fraksi volum pelarut B

Pernyataan yang dipakai untuk memaparkan perilaku linarut tertentu ialah harga k’ atau faktor pemisahan.

tr – tm

k’ = ¾¾¾¾

tm

  

Vr – Vm

k’ = ¾¾¾¾

Vtm

k’, merupakan ukuran berapa banyak linarut ditahan oleh kolom, angka k’ yang tinggi berarti bahwa linarut lama ditahan di dalam kolom. Angka k’ yang dipakai dalam kromatografi gas dan KCKT serat Rf yang dipakai dalam KLT, berbanding terbalik dalam keadaan ideal,

1

Rf = ¾¾¾¾

1 + k’

Untuk mencari hubungan antara k’ dan P’ digunakan persamaan :

k2’                      P1’-P2’/2

¾¾  = 10

k1’

Persamaan di atas berlaku untuk fasa normal, dimana pelarut yang lebih polar menghasilkan harga k’ yang lebih kecil.

Untuk kromatografi fasa balik dimana pelarut yang kepolarannya lebih rendah menghasilkan harga k’ yang lebih kecil, persamaannya :

k2’                      P2’-P1’/2

¾¾  = 10

k1’

3.   Injektor

Cuplikan yang dimaksudkan ke dalam kolom tidak seperti pada metode kromatografi kolom yang konvensional (sistem gravitasi) akan tetapi perlu menggunakan unit penyuntikan. Unit penyuntikan ini dapat menampung sampel dengan berbagai macam variasi banyaknya sampel (tergantung jenis alatnya). Kualitas injeksi cuplikan ke dalam system (menggunakan syringe) perlu dilakukan pengontrolan secara periodik agar dapat selalu terjamin terjadinya volume injeksi yang konstan/stabil (tekanan, kecepatan ,proses injeksi).

a.    Menyiapkan cuplikan

Menyiapkan cuplikan untuk KCKT bergantung pada sumber dan sifat cuplikan. Dalam beberapa kasusu, cuplikan dapat diubah secara kimia untuk menghasilkan senyawa yang mudah dipisahkan atau lebih mudah dideteksi setelah pemisahan. Akan tetapi, pada umumnya cuplikan dilarutkan ke dalam pelarut sedikit, disaring dan disuntikkan ke dalam aliran pelarut. Secara ideal pelarut yang dipakai untuk melarutkan cuplikan seharusnya sama dengan fasa gerak. Untuk pekerjaan analitik, biasanya konsentrasi cuplikan dalam jangka 1 µg/ µl ( 1 mg/ml ). Untuk pekerjaan preparatif konsentrasi lebih besar. Jika cuplikan tidak melarut dengan cukup dalam pelarut yang dipakai untuk kromatografi, harus dipilih pelarut yang kepolarannya lebih rendah dari pelarut pengelusi.

Ukuran cuplikan yang sebenarnya sangat beragam, bergantung pada ukuran kolom, system detector, jenis kromatografi yang dilakukan (analitik atau preparatif) dan tingkat kesukaran pemisahan. Untuk pemisahan analitik dalam kolom kecil, cuplikan ialah 10 -5 g atau lebih kecil per gram kemasan kolom. Untuk pekerjaan preparative dipakai cuplikan sekitar 10 -3 g atau lebih besasr per gram kemasan.

b.    Sistem penyuntikan

Memasukkan cuplikan ke dalam kolom KCKT sama seperti pada Kromatografi gas, yaitu kita harus menyuntikkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak melawan tekanan balik yang mungkin sangat tinggi, dan cuplikan harus dimasukkan berupa sumbat sesempit mungkin untuk memperkecil pelebaran pita.

Cuplikan dapat disuntikan melalui septum karet atau plastik dengan semprit dan jarum asalkan tekanan balik lebih kecil dari 1500 psi. Pada tekanan yang lebih tinggi, pompa dapat dimatikan untuk mengurangi tekanan dan dihidupkan lagi setelah penyuntikan tanpa distorsi kromatografi yang terlalu besar, ini disebut penyuntikan aliran henti. Masalah utama pada septum ialah bahwa partikel cenderung lepas dari septum dan menyumbat sistem.

Sebagian besar penyuntikan sekarang dilakukan dengan memakai sistem katup geser seperti terlihat pada gambar berikut :

Gambar Sistem Penyuntikan Katup Geser

Pada kedudukan pengisian, dalam gambar kanan, larutan cuplikan dimasukkan ke dalam lingkar cuplikan dengan semprit. Ukuran lingkar (volumenya) menentukan ukuran cuplikan, karena biasanya larutan disuntikkan sampai larutan keluar dari pipa limbah. Ketika cuplikan dimasukkan ke dalam lingkar, aliran dari pompa ke kolom tidak terganggu. Ketika katup diputar ke kedudukan penyuntikan pada bagian kanan gambar, pelarut pembawa dibelokkan untuk mengangkut isi lingkar cuplikan ke dalam kolom.

Setelah dipakai, semprit, lingkar cuplikan, pipa limbah, dan katup harus dibersihkan dengan hati hati dengan pelarut segar atau cuplikan berikutnya sebelum dipakai.

4.   Kolom : Fase Diam atau Kemasan

Berikut adalah beberapa fase diam untuk KCKT dan struktur kimianya;

Permukaan tak terikat, polar

Silika                                                                                         Si – OH

Alumina                                                                                   Al – OH

Permukaan terikat, nonpolar

Oktadesil                                                                                             Si - O – Si(CH2)17CH3

Oktil                                                                                          Si - O – Si(CH2)7CH3

                                                                                                                      (CH3)2

Metil                                                                                         Si - O – Si(CH3)3

Fenil                                                                                          Si - O – Si(CH2)3C6H5

                                                                                                                      (CH3)2

Amino                                                                                      Si - O – Si(CH2)3NH2

                                                                                                                      (CH3)2

Siano                                                                                        Si - O – Si(CH2)3CN

                                                                                                                      (CH3)2

Diol                                                                                            Si - O – Si - CH – CH2 – CH2OH

                                                                                                                                        (CH3)2 OH

Kolom mempunyai fungsi untuk memisahkan senyawa yang akan dianalisis sehigga dapat dideteksi secara individual. Fasa diam dapat berupa permukaan zat padat yang berfungsi sebagai medium yang menjerap atau permukaan zat cair yang terdapat pada sejenis zat padat.

a.   Memilih kemasan

Pemilihan kolom (kemasan) yang akan dipakai untuk cuplikan yang sifatnya tidak dikenal harus didasarkan pada sifat kimia umum linarut, sifat kelarutannya dan ukurannya.

Penuntun pemilihan kolom

Kelarutan cuplikan dalam	Kepolaran	Kolom	Sistem
Pelarut Organik	Rendah	Silika	Fase Normal
		Siano
		Amino
		Metil (C1)
		Fenil	Fase Balik
		Oktil (C8)
		Oktadekil (C18)
		Siano
		Metil
Air	Tinggi	Fenil	Fase Balik
		Oktil
		Oktadekil
		Metil
Amino	Non ion	Fenil	Fase Balik
		Oktil
		Oktadekil
	Ion	Metil	Modifikasi ion
		Oktil
		Oktadekil

b.  Rancangan kolom

Disamping sifat kimia dasar kemasan kolom, ada beberapa pilihanlain yang harus ditentukan. Kemasan dapat dilekatkan pada penyangga berpori atau penyangga keras yang ukuran partikelnya dapat beragam. Pada umumnya sebagian besar KCKT dilakukan pada butir berpori dengan garis tengah 3 – 10 µm. Bahan tersebut menghasilkan daya pisah terbaik serta kapasitas tertinggi, tetapi mempunyai kekurangan yaitu memerlukan tekanan yang agak tinggi untuk menjalankannya.

Panjang kolom KCKT biasanya sekitar 5 – 25 cm, berbeda dengan kolom Kromatografi gas yang 0,5 – 30 m atau lebih. Ini disebabkan oleh keefisienan KCKT yang sangat tinggi (lebih dari 100.000 pelat teori/m dibanding dengan 5000 pelat teori/m pada Kromatografi gas) dan akan diperlukan tekanan yang lebih tinggi jika kolom lebih panjang.

c.     Kolom pelindung

Kolom dalam KCKT mahal, tetapi tidak seperti kolom yang dipakai dalam kromatografi kolom konvensional, kolom KCKT dapat dipakai berulang ulang. Untuk melindungi kolom dan memperpanjang masa pakainya, kolom pelindung atau prakolom sering dipasang antara katup pemasukkan dan kolom utama. Kolom pelindung ini sering mengandung kemasan yang serupa dengan kemasan yang dipakai dalam kolom utama, tetapi sering terdiri dari butiran yang lebih kasar, lebih besar ( 20 – 40 µm ) dan tersaputi, bukan bahan berpori seperti yang terdapat di dalam kolom utama. Kolom pelindung pelikel dapat dikemas kering dan kolom pelindung menahan linarut yang dapat menyumbat kolom utama.

5.    Sistem elusi

Berdasarkan eluen yang digunakan :

a.    Sistem elusi isokratik

Eluen dicampur di luar dengan komposisi tepat, digunakan satu atau campuran fase gerak dengan perbandingan yang tepat.

b.    Sistem elusi gradien

            Dengan menggunakan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah pada waktu tertentu.

Berdasarkan tekanan yang digunakan

a.    Sistem elusi tekanan tinggi

Eluen ½ x disemprot dalam KCKT

b.    Sistem elusi tekanan rendah

6.    Sifat elusi

Liquid Chromatography fasa normal :

·      Fasa diam lebih polar daripada fasa gerak ® senyawa polar terelusi belakangan

·      Semakin non polar fasa gerak ® waktu retensinya makin panjang

Liquid Chromatography fasa terbalik :

·      Fasa diam lebih non polar daripada fasa gerak maka senyawa polar terlusi lebih dahulu

·      Semakin  polar fasa gerak maka senyawa yang non polar lebih kuat tertahan

7.   Detektor

Merupakan bagian yang berfungsi untuk mendeteksi senyawa/solute secara kualitatif maupun kuantitatif. Beberapa yang dapat mempengaruhi signal detektor adalah :

·  Variasi flow rate

·  Gelembung udara dalam sistem

·  Fluktuasi

·  Tekanan balik

Sifat yang dipunyai detektor dapat dibagi menjadi berbagai aspek yaitu :

·  Sensitivitas

·  Selektivitas

·  Linearitas

·  Respon detektor

Bermacam-macam jenis detektor, seperti spektrofotometer, spektrofluorometer, refraktometer, konduktometer, radioaktif.

a.    Spektrometer UV – Vis

Digunakan untuk senyawa yang mempunyai respon terhadap sinar UV atau sinar tampak.

b.    Refraktometer

Digunakan untuk senyawa senyawa yang tidak mempunyai kromofor. Kepekaannya lebih rendah dibanding dengan detektor lain. Merupakan detektor umum yang digunakan untuk segala senyawa yang larut dalam fasa gerak. Kelemahan detektor ini adalah :

·      Tidak dapat digunakan dalam keadaan suhu dan tekanan yang berubah ubah

·      Stabilitasnya rendah

c.     Spektrofluorometer

Lebih peka dari pada detektor spektrofotometer UV – Vis maupun refraksi indeks, tetapi senyawa yang diuji sangat terbatas hanya untuk senyawa yang berfluoresensi.

Detektor di atas dikategorikan dalam

a.    BULK PROPERTY DETECTOR

Mengukur sifat solut dan fasa gerak, misal : detektor indeks bias

b.    SOLUTE PROPERTY DETECTOR

Hanya mengukur sifat solut, misal : UV detektor

³ 1000 x sensitif daripada BPD

Dalam lingkup detektor perlu informasi istilah yang sering digunakan :

a.    Noise

Adalah variasi signal detektor yang terlihat pada kertas pencatat tanpa beban solute

b.    Elektronic noise

Seperti noise tetapi disebabkan karena fluktuasi tegangan listrik, frekuensi sirkuit alat dan radio frekuensi. Electronic noise akan dapat terdeteksi pada “base line” yang bergetar sehingga data/garis base line akan berbentuk seperti gambaran rmput.

c.     Long Term noise

Terlihat pada gambaran base line berupa puncak lembah. Penyebab utama :

·       Terdapatnya gas/udara dalam detektor sel

·       Adanya variasi tekanan dan flow rate

·       Variasi temperature

d.    Short Term noise

Terlihat pada gambaran base line yang tampak seperti bulu bulu yang biasanya mempunyai rentang frekuensi 1 cycle / 5 detik

e.    Drift

Terlihat pada base line, walaupun lurus tetapi tidak lagi horizontal melainkan bergerak naik ke atas atau ke bawah (akan menyesatkan analisis kuantitatif). Disebabkan oleh kebocoran pada rangkaian sistem, variasi temperatur, perubahan fasa gerak, gelembung udara dalam detektor.

Kesalahan yang ditimbulkan pada analisis KCKT dapat digolongkan :

1.    Kesalahan sistematik : pola hasil analisis bergeser ke pola lain

2.    Kesalahan random : hasil analisis bertebar disekitar nilai rata-rata

3.    Kesalahan pada alat :

a.    pompa dan sistem pengontrol

b.    sampel yang diinjeksikan

B.    ANALISI KUALITATIF DAN KUANTITATIF DENGAN HPLC

1.   Analisa kualitatif

            dibandingkan dengan standard yaitu tr dan a (efisiensi pelarut)

                                   tr2                                                 Kd2

   retensi relatif = ¾¾                                      a = ¾¾

                                   tr1                                                 Kd1

2.   Analisa kuantitatif

            perbandingan area sampel dengan standard.

            Cara pelaksanaan :

a.    Penormalan area

area

% A = ¾¾¾¾ x 100 %

å area

dengan anggapan :

·    semua zat terelusi sempurna

·    respon detektor sama

·    tanpa zat standar

sesuai untuk komponen yang tidak berdekatan

b.    Faktor koreksi

Dilakukan koreksi detector

Area A / FA

% A = ¾¾¾¾¾¾ x 100 %

å area / FABCD

c.     Standard eksternal

Menggunakan zat standar yang sama dengan sampel,dengan berbagai keadaan, kemudian dibuat grafik area vs kadar dan dihitung koefisien korelasinya.

d.    Standard internal

Menggunakan zat standard yang lain dengan sampel tetapi sifat fisiknya mirip.

e.    Adisi standard

Untuk sampel yang sangat kecil

Sampel + standard dengan kadar bervariasi

Semakin tinggi standard maka area semakin besar

                              LA

Sampel  A = ¾¾¾¾¾¾ x Konsentrasi standar A

                          L standard  A

Dengan catatan :

·    dipilih luasarea yang mendekati

·    koefisien korelasi sesuai

1.    Analisa Kualitatif

tr sampel

tr relatif =  ¾¾¾¾¾

tr baku

tr relatif » 1

2.    Analisa Kuantitatif

LA sampel        mg baku                                            P sampel

           Kadar = ¾¾¾¾¾ x ¾¾¾¾¾ x BR 10 tablet x ¾¾¾¾¾ x 100 %

LA baku         mg sampel                                         P baku

           

LA : Luas area  P : Pengenceran                               BR : Bobot rata-rata

C.    KESESUAIAN SISTEM

Sebelum sistem KCKT digunakan harus dilakukan pengujian fungsi alat yang disebut Uji Kesesuaian Sistem. Tujuan uji kesesuaian sistem adalah untuk mengetahui apakah sistem kromatografi yang digunakan memenuhi syarat yang telah ditentukan dalam monografi sehingga mutu data yang dihasilkan dapat dipercaya dan dipertanggungjawabkan.

Berdasarkan FI Ed. IV / 1995, data uji kesesuaian sistem dari hasil penyuntikan berulang  ( 5 – 6 kali ) baik  larutan baku maupun larutan uji.

Parameter uji kesesuaian sistem meliputi:

1.    Presisi ( % RSD )

100        S ( xi – x )2          1/2

RSD ( % ) = ¾¾                    ¾¾¾¾¾¾

X              N – 1

Keterangan :

RSD ( % ) = simpangan baku relatif dalam %

Xi                = hasil suatu pengukuran individual

N                                = jumlah pengukuran yang dilakukan

X                 = harga rata-rata pengukuran

Presisi adalah merupakan salah satu parameter uji yang berguna untuk menguji keberulangan dari penyuntikan ulang yang mengandung analit. Keberulangan dari penyuntikan ulang umumnya dinyatakan dalam simpangan baku relatif.

Penyuntikan ulang dari larutan baku umumnya dinyatakan dalam masing-masing monografi. Jika batas RSD yang ditetapkan kurang dari atau sama dengan 2,0 % maka digunakan penyuntikan ulang 5 kali, sedangkan jika batas RSD yang ditetapkan lebih dari 2,0 % maka digunakan data dari 6 kali penyuntikan ulang.

2.    Faktor ikutan ( tailing factor )

Faktor ikutan merupakan kesimetrisan suatu puncak. Keakuratan akan berkurang jika faktor ikutan bertambah. Faktor ikutan dapat dinyatakan dengan rumus :

       

W0,05

T = ¾¾¾

         2 f

       

W0,05               =     lebar puncak pada 5 % tinggi

F                         =     jarak dari maksimum puncak sampai tepi muka puncak, diukur pada titik dengan ketinggian 5 % dari tinggi puncak terhadap garis dasar.

3.    Efisiensi kolom

Efisiensi kolom adalah jumlah pelat dan merupakan ukuran ketajaman suatu puncak. Jumlah pelat teori dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut :

t

N = 16 ( ¾¾ ) 2

W

t = waktu retensi diukur saat penyuntikan samapai saat elusi maksimum puncak (detik)

W = lebar puncak ( mm )

Faktor faktor yang berpengaruh terhadap efisiensi kolom adalah ukuran partikel dan suhu kolom, laju alir dan viskositas fasa gerak, serta berat molekul zat uji. Pada umumnya jumlah lempeng teoritis lebih 2000 dianggap cukup memadai.

4.    Resolusi

Resolusi adalah suatu ukuran seberapa baik dua puncak terpisah sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif secara akurat

2 ( t2 – t1 )

R = ¾¾¾¾¾

           W1 + W2

             t1 dan t2       = waktu retensi dari dua puncak kromatografi

W1 dan W2= lebar puncak puncak yang diukur dengan cara ekstrapolasi sisi puncak yang relatif lurus terhadap garis datar

Untuk mendapatkan pemisahan yang baik nilai resolusi lebih besar 1,5.

5.    Faktor kapasitas

Faktor kapasitas adalah suatu parameter yang menyatakan kemampuan suatu zat tertentu untuk berinteraksi dengan system kromatografi. Faktor kapasitas dapat dirumuskan sebagai berikut :

Jumlah zat fasa tetap

K’ = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾

Jumlah zat fasa gerak

t                t - to

K’ = ¾¾ - 1 = ¾¾¾

to                   to

t = waktu retensi dari zat

to = waktu retensi dari puncak yang ditahan kolom

Untuk pemisahan yang baik nilai k’ harus lebih besar dari 2.

6.    Retensi relatif

Retensi relatif ialah ukuran dari letak relatif dua puncak dan dinyatakan dengan rumus sebagai berikut :

k’2             t2 - to

a = ¾¾¾ = ¾¾¾¾

k’1             t1 - to

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal ini yang menyebabkan pemisahan.

Kromatotron

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan adsorpsi dan partisi. Adsorpsi adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI VAKUM CAIR

·      Pada prinsipnya adalah kromatografi kolom yang dipercepat proses elusinya dengan bantuan alat vakum (penghisapan)=> waktu lebih cepat, lazimnya hanya 2 – 3 jam saja.

·      Tujuan KVC, untuk fraksinasi senyawa-senyawa dalam suatu ekstrak (menyederhanakan campuran senyawa)

Tahapan pelaksanaan KVC :

1.    Pencarian eluen yang akan digunakan untuk KVC

Prinsipnya :

· dicari eluen yang memisahkan noda kromatogram dengan Rf mulai  0,1 hingga Rf = 0,5.

· untuk menghemat pelarut,  biaya lebih murah & menghindari efek toksik yang terjadi, lazimnya digunakan campuran n-heksana:etilasetat.

2.    Penyiapan kolom KVC

Prinsipnya :

· Berat sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter kolom KVC yang akan digunakan, dengan arahan ketentuan :

Berat sampel (g)	Diameter kolom KKT (cm)	Silika kolom (g)	Perbandingan sampel : silica kvc
15 – 25	14	150 – 250	1 : 10 – 1 : 15
3 – 5	10	60 – 125	1 : 20 – 1 : 25
1 – 2	7	30 – 80	1 : 30 – 1 : 40

· Tinggi silica dalam kolom KVC lazimnya hanya 5  cm, hingga tinggi maksimal = diameternya (Silica G 60, Katalog Merck : 7730/7731)

· Packing kolom dilakukan dengan cara : silica dalam kolom KVC dengan dibantu vakum, ditekan-tekan hingga rata, selanjutnya  dihomogenkan dengan eluen (fase gerak) n-heksana.

Catatan : Kolom telah homogen, jika silica tidak ada yang retak & waktu dialiri eluen merata

3.    Penyiapan sampel dengan impregnasi

· Sampel dilarutkan dalam pelarut yang paling sesuai (larut dengan sempurna). Jika ada sebagian tidak larut, hendaknya sampel yang tidak larut tersebut dipisahkan terlebih dahulu dari larutan dengan penyaringan biasa. Larutan sampel kemudian dicampurkan dengan silika gel impreg (mesh 30 – 70, Katalog : 7733) dengan perbandingan 1:2 antara sampel dengan silica, dan diuapkan pada tekanan rendah menggunakan rotary epaporator sampai kering (bebas pelarut).

· Sampel yang sudah di-impregnasi dimasukkan ke dalam kolom KVC, dan pada bagian atas sampel diberi kertas saring untuk menghindari penyebaran ekstrak kedalam eluen.

4.    Fraksinasi

Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan eluen yang telah terpilih, jumlah fraksi lazimnya hanya 12 – 20 fraksi untuk fraksinasi tahap pertama. Volume eluen untuk setiap kali elusi tergantung dari diameter kolom KVC, dengan arahan sbb. :

Berat sampel (g)	Diameter kolom KKT (cm)	Volume eluen per-elusi (mL)
15 – 25	14	100 – 175
3 – 5	10	75 – 125
1 – 2	7	50 – 75

5.    Pemekatan fraksi dengan cara evaporasi

Pemekatan fraksi dilakukan untuk tujuan agar saat masing-masing fraksi ditotolkan dalam plat KLT, lebih pekat sehingga mempercepat dalam penotolan & noda kromatogram lebih baik.

6.    Analisis KLT hasil fraksinasi

Masing-masing fraksi hasil KKT ditotolkan pada plat KLT, dibandingkan dengan sampel/ekstrak dan standar (chemical marker standar, jika punya). Eluen yang dapat digunakan untuk analisis KLT adalah eluen yang memberikan nilai Rf 0,2 – 0,8 untuk noda-noda kromatogram yang diamati. Fraksi yang memberikan noda kromatogram tunggal dan memiliki Rf sama dengan standar, menunjukkan senyawa murni hasil isolasi yang sama dengan standarnya, selanjutnya digabungkan.

7.    Penggabungan fraksi

Berdasarkan analisis KLT terhadap fraksi-fraksi, maka fraksi yang memiliki noda-noda kromatogram yang mirip dengan nilai Rf yang sama digabungkan, selanjutnya dievaporasi untuk ditentukan beratnya. Fraksi gabungan yang memiliki noda kromatogram lebih sederhana dengan berat yang signifikan dapat dilanjutkan untuk pemurnian. Atau fraksi gabungan yang memiliki noda kromatogram dari chemical marker yang akan diisolasi, dimurnikan lebih lanjut dengan cara KKT atau kromatografi radial atau KLT preparative.

PEMURNIAN FRAKSI DENGAN CARA KROMATOGRAFI KOLOM TEKAN

Tahapan pelaksanaan KKT :

1.    Pencarian eluen untuk pemurnian.

Prinsipnya :

·  dicari eluen yang memisahkan noda kromatogram yang terbaik, dengan Rf = 0,2 – 0,3.

· untuk senyawa flavonoid & turunannya, lazimnya dipakai campuran               (kloroform:n-heksana), (kloroform:etilasetat) atau (kloroform:methanol) tergantung sifat polaritas dari chemical marker yang akan dimurnikan.

· Untuk senyawa terpenoid, lazimnya dipakai campuran n-heksana:etilasetat atau                             n-heksana:kloroform.

2.    Penyiapan kolom KKT

Prinsipnya :

· Berat sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter kolom KKT yang akan digunakan, dengan arahan ketentuan :

Berat sampel (mg)	Diameter kolom KKT (cm)
< 50	1
100 – 250	2
250 – 500	3

·  Tinggi silica dalam kolom 15 – 17 cm (Silica G 60 mesh 60 – 200, Katalog Merck : 7734)

· Silica dalam kolom KKT dihomogenkan dengan eluen (fase gerak) yang telah terpilih untuk pemurnian, hingga tidak nampak adanya gelembung-gelembung udara (eluen boleh diulang-ulang untuk dimasukkan dalam kolom KKT). Catatan : selama mengelusi tidak boleh kering, eluen melewati batas atas silica dalam kolom.

3.    Penyiapan sampel dengan silica impreg (mesh 30 – 70, Katalog : 7733)

Sampel dilarutkan dalam pelarut yang paling sesuai (larut dengan sempurna). Jika ada sebagian tidak larut, hendaknya sampel yang tidak larut tersebut dipisahkan terlebih dahulu dari larutan dengan penyaringan biasa. Larutan sampel kemudian dicampurkan dengan silika gel (dengan perbandingan 1:2 antara sampel dengan silica), dan diuapkan pada tekanan rendah menggunakan rotary epaporator sampai kering (bebas pelarut). Sampel yang sudah di-impregnasi dimasukkan ke dalam kolom KKT, dan pada bagian atas sampel diberi kapas secukupnya saja.

4.    Fraksinasi/pemurnian dengan KKT

Fraksinasi dengan kolom KKT bertujuan untuk mendapatkan senyawa murni dalam beberapa fraksi hasil pemisahan dengan KKT. Eluen yang digunakan lazimnya hanya satu system campuran pelarut (polaritasnya tetap), lazimnya dibutuhkan 250 – 500 mL.

Masing-masing fraksi ditampung dengan volume = 5 – 20 mL. Dan sebelum dihentikan atau dibongkar, fraksi yang terakhir dianalisis KLT dengan dibandingkan dengan sampelnya. Jika semua senyawa atau chemical marker target sudah keluar semua, proses fraksinasi dapat dihentikan.

5.    Analisis KLT hasil fraksinasi/pemurnian

Masing-masing fraksi hasil KKT ditotolkan pada plat KLT, dibandingkan dengan sampel/ekstrak dan standar (chemical marker standar, jika punya). Eluen yang dapat digunakan untuk analisis KLT adalah eluen yang memberikan nilai Rf 0,2 – 0,8 untuk noda-noda kromatogram yang diamati. Fraksi yang memberikan noda kromatogram tunggal dan memiliki Rf sama dengan standar, menunjukkan senyawa murni hasil isolasi yang sama dengan standarnya, selanjutnya digabungkan.

6.    Analisis kemurnian hasil isolasi

Fraksi gabungan yang memberikan noda kromatogram tunggal dengan nilai Rf  sama dengan standarnya, dielusi dengan 3 (tiga) system eluen yang berbeda-beda (sifat polaritasnya). Misal; system I campuran heksana:etilasetat; system II campuran kloroform:methanol; system III campuran heksana:kloroform:etilasetat.

Jika dengan 3 system eluen yang berbeda tersebut, menunjukkan noda kromatogram tunggal dapat disimpulkan bahwa isolat tersebut telah murni.  Jika belum murni, biasanya memerlukan 1 tahapan kromatografi lagi untuk memurnikannya. Jika telah murni dapat ditentukan kandungan chemical marker dalam ekstrak dengan metode densitometer (TLC scanner) atau HPLC.